【摘要】：齲病是發(fā)生在牙體硬組織的慢性細菌性疾病,多呈不可逆、漸進性進展趨勢。根據發(fā)病部位不同,齲病可分為根面齲(root caries, RC)和冠齲(root caries, RC)兩種類型。雖然同屬齦上菌斑性疾病,但與冠齲相比,根面齲發(fā)病更隱蔽、不易修復且危害較大。截至2012年底,中國60周歲以上的老年人口已達1.94億,2020年將達到2.43億,2025年將突破3億。隨著人口老齡化日益加劇,根面齲發(fā)病率不斷上升,將嚴重影響中老年人生命、生活質量。因此,根面齲的病因學研究、風險因素評估以及預防都是當今齲病學研究的重點和熱點。 目前公認的齲病病因學說是四聯因素學說,主要包括細菌(bacteria)、飲食(substrate)、宿主(host)和時間(time),其中細菌微生物因素至關重要。然而口腔菌群是人體內最為復雜的微生物群落之一,一直以來人們對口腔微生物群落了解的深度和廣度十分有限,并且針對根面齲的研究數目較少,研究方法落后,目前根面齲相關微生物病因仍然存在爭議。本研究采用新一代高通量454GS FLX Titanium測序技術和實時定量PCR (quantitative real time PCR, qPCR)技術,分三部分研究老年人根面齲菌斑和唾液微生物群落構成,探索根面齲微生物細菌學病因。 第一部分老年人根面齲患者和健康人牙菌斑微生物群落的宏基因組學研究 實驗一根面齲患者和健康人菌斑微生物細菌譜系分析與比較 [目的]根面齲發(fā)病率高、危害大且細菌學病因仍存爭議。本研究通過對比分析根面齲和健康人牙菌斑微生物群落細菌譜系,為尋找根面齲細菌學病因提供依據。 [方法]分別收集根面齲患者根面齲齲壞牙菌斑(疾病組)、無齲牙菌斑(疾病對照組)和健康人無齲牙菌斑(健康對照組)樣品,提取細菌基因組DNA,擴增16S rRNA V3-V5片段,采用454焦磷酸高通量測序,經HOMD數據庫確定種屬信息,比較分析三組牙菌斑微生物細菌譜系及構成。 [結果]健康對照組的Alpha多樣性(chaol豐度指數和shannon多樣性指數)高于疾病組,但無統(tǒng)計學意義(p0.05)。Beta多樣性(未加權UniFrac和加權UniFrac)結果顯示健康人之間的群落結構更為保守,根面齲人群更為分散、變異更大(p0.05)。主成分分析(PCoA)顯示根面齲疾病組和健康對照組呈分離趨勢,疾病對照組位于兩者之間更傾向于健康人群。通過門、屬、種不同等級水平的定性、定量結果比較,展示了三組菌斑微生物細菌群落組成,并發(fā)現了一系列可能與根面齲相關的“風險因子”以及和健康相關的“保護性因子”。發(fā)現了不同疾病狀態(tài)下齦上菌斑菌群存在核心微生物。 [結論]本研究結果提示健康人牙菌斑細菌群落結構較根面齲患者更為保守；發(fā)現產酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidifaciens),變形鏈球菌(Streptococcus mutans), Olsenella profusa, Prevotella multisaccharivorax和卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)與根面齲密切相關,而代爾夫特食酸菌(Delftia acidovorans), Bacteroidetes[G-2] sp., Lachnospiraceae[G-3] sp.和中間普氏菌(Prevotella intermedia)與健康相關聯；口腔齦上菌斑細菌群落存在核心微生物,其中7種細菌與根面齲密切相關而在健康菌斑中很少或沒有表達,被認為是潛在致齲核心微生物。 實驗二根面齲患者和健康人菌斑細菌總量的檢測及454測序方法學的驗證 [目的]定量檢測并比較三組菌斑樣品細菌總量和三種常見細菌(變形鏈球菌、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬)DNA水平。比較實時定量PCR和454結果以驗證454測序方法的可靠性和可重復性。 [方法]分別收集根面齲患者根面齲齲壞牙菌斑(疾病組)、無齲牙菌斑(疾病對照組)和健康人無齲牙菌斑(健康對照組)樣品,提取細菌基因組DNA,采用實時定量PCR技術檢測三組細菌總量和三種目標細菌DNA水平,比較分析qPCR結果和454結果。 [結果]疾病對照組的細菌總量DNA水平最高,顯著高于根面齲疾病組(p0.05)。健康對照組細菌總量高于疾病組,低于疾病對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。對比發(fā)現三種目標細菌qPCR結果和454測序結果基本相似,兩種獨立檢測方法得到的定量結果較為一致。 [結論]健康狀態(tài)(健康對照組、疾病對照組)菌斑細菌總量DNA水平高于疾病狀(根面齲疾病組)態(tài)菌斑細菌總量。454焦磷酸測序技術手段可靠穩(wěn)定,結果具有可重復性。 第二部分根面齲和冠齲菌斑微生物群落的細菌學分析 [目的]齲病可分為根面齲和冠齲兩種類型。目前的觀點認為根面齲的細菌菌群組成和冠齲不同,本研究通過對比分析根面齲和冠齲菌斑微生物生物群落組成,以驗證根面齲和冠齲微生物群落是否相同,并為尋找齲病細菌學病因提供依據。 [方法]分別收集根面齲齲壞牙菌斑(根面齲組)、冠齲齲壞牙菌斑(冠齲組)、齲壞患者健康牙菌斑(疾病對照組)和健康人無齲牙菌斑(健康對照組)樣品,提取細菌基因組DNA,擴增16S rRNA V3-V5片段,采用454焦磷酸高通量測序,經HOMD數據庫確定種屬信息,比較分析四組菌斑微生物細菌譜系及構成。 [結果]根面齲組的Alpha多樣性(species物種指數、chaol豐度指數和shannon和simpson多樣性指數)高于冠齲組,但無統(tǒng)計學差異(p0.05)。未加權UniFrac Beta多樣性顯示健康對照組樣品之間的群落結構更為保守,顯著低于其他三組(p0.05)；加權UniFrac Beta多樣性顯示根面齲組樣品之間相距較最遠、最為分散,顯著高于冠齲組和健康對照組(p0.05)。主成分分析(PCoA)顯示根面齲組和冠齲組分布類似呈聚集趨勢,與健康對照組呈分離趨勢。通過在不同等級水平的定性、定量結果以及共有和特有OTU走勢曲線,展示了根面齲和冠齲菌斑菌群組成相似,并且存在共同核心微生物。通過對比冠齲組和健康對照組菌群組成發(fā)現了多種齲相關細菌和健康相關細菌。 [結論]本研究結果提示冠齲牙菌斑和健康無齲牙菌斑群落結構較根面齲患者更為保守；通過對比根面齲和冠齲菌斑微生物組成的定性、定量信息,主成分分析結果以及共有OTU和特有OTU走勢曲線,發(fā)現根面齲和冠齲細菌群落構成和核心微生物都較為相似,提示參與根面齲和冠齲致齲微生物可能相同或相似。另外對比冠齲組和健康對照組微生物菌群組成,發(fā)現產酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidifaciens),變形鏈球菌(Streptococcus mutans), Olsenella profusa,唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)和Oribacterium sp.與齲病相關聯,而Bacteroidetes [G-2], Fusobacterium sp., Capnocytophaga leadbetteri,中間普氏菌(Prevotella intermedia)以及Prevotella sp.和健康相關。 第三部分老年人根面齲患者和健康人唾液相關致齲菌的研究 [目的]根面齲在中老年人群中發(fā)病率高、危害大,常發(fā)生在暴露根面部位,長期浸泡在唾液之中,受唾液影響較大。本實驗定量檢測唾液中五種常見致齲菌DNA水平并評價與根面齲的關系。 [方法]分別收集根面齲患者唾液(根面齲組)和健康人唾液(健康對照組)共43個樣品,提取細菌基因組DNA,采用實時定量PCR檢測五種細菌(變形鏈球菌、茸毛鏈球菌、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、內氏放線菌)唾液DNA水平,分析與根面齲齲壞指數(根面齲補牙面數和根面齲指數)的關系。 [結果]定性結果顯示根面齲組的茸毛鏈球菌發(fā)病率顯著高于健康對照組(p0.05),根面齲組變形鏈球菌、茸毛鏈球菌、雙歧桿菌任意雙陽性檢出率顯著高于健康對照組(p0.05)。定量結果顯示比變形鏈球菌、茸毛鏈球菌、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬在根面齲患者唾液中DNA水平顯著高于健康對照組(p0.05)。相關性分析結果顯示變形鏈球菌、茸毛鏈球菌、雙歧桿菌屬和根面齲補牙面數以及根面齲指數顯著正相關(p0.05)。 [結論]雙陽性檢出率敏感性高于單陽性敏感率,可能更適合作為根面齲風險評估指標。變形鏈球菌、茸毛鏈球菌和雙歧桿菌屬定量結果顯示和根面齲齲壞程度密切相關,可考慮作為根面齲風險評估生物指標。
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【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.1

【參考文獻】

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1 姚冬琴;;中國養(yǎng)生老不及格? 三大指數兩個低于60分[J];中國經濟周刊;2014年07期

2 馬善奮;梁景平;姜云濤;朱彩蓮;;老年根面齲牙菌斑群落組成的多樣性觀察[J];上海口腔醫(yī)學;2011年04期

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本文編號：2299042