【摘要】：牙周炎是常見的慢性炎癥性疾病，它可以導致牙周組織不可逆性的破壞，同時炎癥可以刺激血管形成，破壞的牙周組織處有大量的炎性肉芽組織形成。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）定植在牙周膜中并具有多向分化能力。有研究證實間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）的分化是受組織微環(huán)境調(diào)節(jié)的。同樣牙周膜干細胞的分化也受組織微環(huán)境的調(diào)控。有報道顯示，由于炎癥微環(huán)境中存在大量的血管形成因子，這些因子有利于干細胞向內(nèi)皮細胞分化。那么牙周炎癥微環(huán)境是否促進牙周膜干細胞的內(nèi)皮向分化以及調(diào)節(jié)其內(nèi)皮向分化的機制還不清楚。基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是存在于牙周炎癥微環(huán)境中與牙周炎發(fā)展密切相關(guān)的重要因子。SDF-1α是重要的血管形成因子，它可以誘導趨化因子受體4[chemokine(c-x-c motif) receptor4，CXCR4]陽性表達的間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮樣細胞。促炎因子TNF-α是SDF-1α/CXCR4軸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，TNF-α可以通過上調(diào)SDF-1α或CXCR4的表達促進SDF-1α/CXCR4軸介導的反應。在本研究中將初步觀察TNF-α和SDF-1α/CXCR4軸在牙周膜干細胞內(nèi)皮向分化中的作用及二者之間的調(diào)控關(guān)系。 研究目的： 初步探討炎癥微環(huán)境下牙周膜干細胞內(nèi)皮向分化能力及其分子機制。 研究方法： 1.采用酶消化聯(lián)合組織塊法培養(yǎng)正常及炎癥牙周組織來源的牙周膜干細胞；克隆形成實驗觀察兩種干細胞的克隆形成能力；流式細胞儀檢測兩種干細胞表面分子標志物的表達；成骨誘導后茜素紅染色并進行定量分析比較兩種干細胞的成骨分化能力。 2.Real-time PCR檢測兩種干細胞中SDF-1α、CXCR4表達的差異；SDF-1α誘導兩種干細胞，Real-time PCR檢測血管內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、vWF的表達差異；Matrigel基質(zhì)膠管腔形成實驗觀察兩種干細胞管腔形成情況，倒置顯微鏡下拍照，統(tǒng)計管腔形成數(shù)量并進行比較。 3.CCK-8法檢測TNF-α對牙周膜干細胞生長的影響；Real-time PCR檢測TNF-α對牙周膜干細胞SDF-1α、CXCR4表達的影響。 4.利用Real-time PCR和Western Blot比較單純SDF-1α誘導組、TNF-α預處理后SDF-1α誘導組、TNF-α預處理后AMD3100阻斷再加SDF-1α誘導組的血管內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、vWF、KDR和蛋白vWF、VE-cadherin的表達情況；Matrigel基質(zhì)膠管腔形成實驗觀察TNF-α預處理后SDF-1α誘導組和TNF-α預處理后AMD3100阻斷再加SDF-1α誘導組的管腔形成情況。 研究結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)的兩種牙周膜干細胞細胞形態(tài)為長梭形并呈漩渦狀或放射狀排列，具有間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征及克隆形成能力；流式細胞儀結(jié)果顯示兩種干細胞均陽性表達CD105、CD90、CD29、CD146，陰性表達CD34、CD45、CD31；茜素紅染色顯示經(jīng)誘導后的兩種干細胞均可見礦化結(jié)節(jié)形成，定量分析結(jié)果顯示炎癥牙周組織來源的牙周膜干細胞成骨能力較弱。 2.Real-time PCR結(jié)果顯示炎癥牙周組織來源的牙周膜干細胞低表達SDF-1α、高表達CXCR4；兩種干細胞經(jīng)SDF-1α誘導后，，血管內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、vWF表達水平和管腔形成能力均明顯高于未經(jīng)SDF-1α誘導的對照組，兩種細胞間相比，經(jīng)SDF-1α誘導后的炎癥牙周組織來源的牙周膜干細胞中的CD31mRNA、vWF mRNA的表達水平和管腔形成能力均明顯高于正常牙周組織來源的牙周膜干細胞。 3.CCK-8法結(jié)果顯示1ng/mL TNF-α和10ng/mL TNF-α對牙周膜干細胞生長無明顯影響，100ng/mL TNF-α明顯抑制牙周膜干細胞的生長；Real-time PCR結(jié)果顯示10ng/mL TNF-α抑制牙周膜干細胞表達SDF-1α，促進牙周膜干細胞表達CXCR4。 4.Real-time PCR和Western Blot顯示牙周膜干細胞經(jīng)TNF-α預處理后加SDF-1α誘導組其血管內(nèi)皮相關(guān)基因和蛋白表達水平均明顯高于單純SDF-1α誘導組；同時經(jīng)TNF-α預處理后加入CXCR4抑制劑AMD3100再加SDF-1α誘導的實驗組，血管內(nèi)皮相關(guān)基因和蛋白表達水平以及管腔形成能力均明顯降低。 結(jié)論: 炎癥微環(huán)境可以促進牙周膜干細胞的內(nèi)皮向分化能力，其分子機制為TNF-α通過上調(diào)牙周膜干細胞表達CXCR4，使其對環(huán)境中的SDF-1α更加敏感，從而使牙周膜干細胞的內(nèi)皮向分化能力增強。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.42

【共引文獻】

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本文編號：2274613