【摘要】：不利生存環(huán)境可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變,而細(xì)胞通過誘發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),防止細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡。在既往關(guān)于UPR與慢性牙周炎的相關(guān)性研究中,已經(jīng)證實(shí)UPR標(biāo)志性分子X盒結(jié)合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP-1)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)表達(dá)水平與牙周炎組織中炎癥的破壞程度呈正相關(guān)[1];本課題組前期研究也已經(jīng)證實(shí)炎癥來源的牙周膜干細(xì)胞(P-PDLSC)中UPR被激活[2];但來自于慢性牙周炎組織的牙周膜成纖維細(xì)胞是否同樣處于UPR狀態(tài)尚無報(bào)道。牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中功能最重要的細(xì)胞,其最主要功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和代謝,同時(shí)也具有很多類似固有免疫細(xì)胞的功能,例如表達(dá)模式識別受體并識別病原體相關(guān)分子模式,分泌細(xì)胞因子及趨化因子,調(diào)節(jié)固有免疫及獲得性免疫細(xì)胞的增殖、遷移和活化。炎癥來源的牙周膜成纖維細(xì)胞如果也像P-PDLSC一樣處于UPR狀態(tài),UPR對于其免疫功能會有怎樣的影響?在牙周炎癥發(fā)生發(fā)展過程中,巨噬細(xì)胞的M1/M2極化狀態(tài)和細(xì)胞因子的分泌在病原體的清除及組織改建中均發(fā)揮著重要作用。M1型巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥發(fā)展、促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解;M2型巨噬細(xì)胞則通過分泌對炎癥有抑制作用的細(xì)胞因子及多種生長因子,抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。在炎癥發(fā)展的不同階段M1、M2細(xì)胞的比例及功能亦不同,過度極化或者表型之間的轉(zhuǎn)化障礙都將影響炎癥的預(yù)后。既往關(guān)于HPDLF對于巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用報(bào)道很多,但關(guān)于HPDLF的UPR狀態(tài)是否參與細(xì)胞對于巨噬細(xì)胞極化的影響尚無報(bào)道。白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體-1(LAIR-1)是表達(dá)于大部分免疫細(xì)胞表面的一種免疫抑制性受體,LAIR-1在經(jīng)過單克隆抗體(m Ab)交聯(lián)活化后,可傳遞強(qiáng)烈的抑制性信號。但關(guān)于LAIR-1與單核巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)研究國內(nèi)外尚無報(bào)道。LAIR-1已被證實(shí)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的發(fā)病有著密切的聯(lián)系,并且可以抑制破骨細(xì)胞的破骨分化。牙周炎與RA有著相似的發(fā)病機(jī)制,膠原異常代謝、單核巨噬細(xì)胞的極化和破骨細(xì)胞的分化都在這兩種疾病的發(fā)展中起到重要的作用。但目前尚無有關(guān)LAIR-1與牙周疾病的相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本研究通過體外分離培養(yǎng)的正常及炎癥來源的人牙周膜成纖維細(xì)胞,比較二者的UPR狀態(tài)有無差異;應(yīng)用UPR誘導(dǎo)劑TM、TG預(yù)處理HPDLF,探討UPR狀態(tài)的HPDLF對LPS的反應(yīng)性有無變化,同時(shí)通過間接共培養(yǎng)檢測其對于巨噬細(xì)胞極化的影響與正常細(xì)胞有無差異,并探索這種差異可能的分子機(jī)制。本研究主要分為以下三部分:第一部分:炎癥微環(huán)境對HPDLF中UPR相關(guān)分子表達(dá)的影響【研究目的】1、比較UPR相關(guān)基因在健康來源的牙周膜成纖維細(xì)胞(H-HPDLF)和炎癥來源的牙周膜成纖維細(xì)胞(P-HPDLF)中的表達(dá)差異;2、體外模擬牙周炎微環(huán)境,探討牙周膜成纖維細(xì)胞UPR的可能誘因�！狙芯糠椒ā�1、通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析H-HPDLF和P-HPDLF中UPR相關(guān)基因GRP78、CHOP、XBP-1、XBP-1s、PERK、IRE-1、ATF-6 m RNA的表達(dá)差異。2、TNF-α(10ng/ml)、IL-1β(0.1ng/ml)、LPS(100ng/ml)分別作用HPDLF(作用時(shí)間為12、24、48h),q RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測HPDLF中UPR相關(guān)分子蛋白及m RNA的表達(dá)水平�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】證實(shí)體外分離培養(yǎng)的P-HPDLF中GRP78、CHOP、PERK、XBP-1s m RNA的表達(dá)水平明顯高于H-HPDLF。與對照組相比,LPS、TNF-α、IL-1β分別作用HPDLF均可以明顯增加GRP78、PERK、CHOP和XBP-1s m RNA的表達(dá)水平,同時(shí)增加GRP78、PERK、CHOP蛋白的表達(dá)水平�！窘Y(jié)論】初步證實(shí)體外培養(yǎng)P-HPDLF中UPR處于活化狀態(tài);并首次證實(shí)LPS、TNF-α、IL-1β均可以體外誘導(dǎo)H-HPDLF發(fā)生UPR。第二部分UPR狀態(tài)對HPDLF免疫相關(guān)功能的影響【研究目的】1、觀察TLR4活化后的HPDLF對巨噬細(xì)胞極化是否具有調(diào)節(jié)功能;2、觀察處于UPR狀態(tài)的HPDLF促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化的功能是否受到影響;3、觀察處于UPR狀態(tài)的HPDLF細(xì)胞因子的分泌、表面模式識別受體TLR4/CD14的表達(dá)、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路的活化是否受到影響�！狙芯糠椒ā�1、LPS處理HPDLF后與THP-1共培養(yǎng),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測THP-1表面CCR7、CD86、CD163、CD206及胞內(nèi)IL-10、Arginase-1的表達(dá)水平變化,通過q RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子m RNA的表達(dá)水平變化;2、TM預(yù)處理HPDLF 6h,LPS處理HPDLF 12h后與THP-1或CD14免疫磁珠分選的外周血中的單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測極化相關(guān)分子的表達(dá);3、TM預(yù)處理HPDLF 6h,LPS處理HPDLF 12h,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的濃度;q RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面CD14、TLR4的表達(dá)水平;Western Blot檢測NF-κB通路活化情況�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、LPS處理HPDLF后與THP-1共培養(yǎng),THP-1表面CCR7、CD86蛋白及m RNA表達(dá)水平顯著增加,IL-1β、TNF-α、IL-12的m RNA表達(dá)水平均顯著增高;IL-10及Arginase-1蛋白表達(dá)水平降低,CD163、CD206沒有明顯變化;2、TM、TG預(yù)處理HPDLF 6h后,與對照組相比,預(yù)處理組細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的功能受到抑制,表現(xiàn)為共培養(yǎng)體系中的THP-1、外周血CD14+單核細(xì)胞表面CCR7、CD86明顯下降;3、經(jīng)ELISA檢測,TM、TG預(yù)處理的HPDLF對于LPS的免疫反應(yīng)出現(xiàn)鈍化,具體體現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8濃度降低,同時(shí)q RT-PCR結(jié)果顯示上述四個分子的m RNA表達(dá)水平降低。4、流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示LPS可以增加HPDLF表面TLR4的表達(dá),但TM、TG預(yù)處理的HPDLF表面TLR4低于對照組。Western Blot結(jié)果顯示TM預(yù)處理對于NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、I-κB及磷酸化I-κB沒有影響,但可以減少由LPS所介導(dǎo)的NF-κB p65的表達(dá)增加及磷酸化水平增加。TG預(yù)處理具有一定增加NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65的能力(P0.01),但TG預(yù)處理可以抑制由LPS所介導(dǎo)NF-κB p65的增加以及NF-κB p65和I-κB的磷酸化�！窘Y(jié)論】UPR狀態(tài)的細(xì)胞對于LPS作用的反應(yīng)性出現(xiàn)下降,表現(xiàn)在模式識別受體減少,炎性細(xì)胞因子分泌減少、炎癥相關(guān)通路NF-κB的活化程度下降,同時(shí)UPR的活化對于HPDLF促進(jìn)M1極化的功能起到一定限制作用。第三部分:UPR狀態(tài)HPDLF對巨噬細(xì)胞表面抑制性分子LAIR-1表達(dá)的影響【研究目的】1、體外模擬牙周炎微環(huán)境,觀察單核巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子的表達(dá)水平變化;2、檢測LAIR-1分子對于細(xì)胞極化的影響�！狙芯糠椒ā�1、TNF-α(0.25ng/ml)、IL-1β(0.1ng/ml)、E.coli LPS(100ng/ml)、P.g LPS(100ng/ml)分別作用THP-1,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面LAIR-1的表達(dá)水平;2、TM預(yù)處理HPDLF 6h,LPS處理HPDLF 12h后與THP-1,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子的表達(dá)水平變化;3、單克隆抗體交聯(lián)活化單核巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子,流式細(xì)胞術(shù)及q RT-PCR檢測單核巨噬細(xì)胞M1及M2極化情況�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:與對照組相比,TNF-α、IL-1β、E.coli LPS、P.g LPS均可以明顯減少巨噬細(xì)胞表面LAIR-1的表達(dá)水平;經(jīng)過E.coli LPS預(yù)處理的HPDLF與THP-1共同培養(yǎng)亦可減少巨噬細(xì)胞表面LAIR-1的表達(dá)水平;同對照組相比,與UPR狀態(tài)HPDLF共同培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞其表面LAIR-1表達(dá)水平得以部分恢復(fù)。2、單克隆抗體91C3可以交聯(lián)活化單核巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子,流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:巨噬細(xì)胞表面由IFN-γ所誘導(dǎo)的CCR7、CD86的表達(dá)增加受到91C3交聯(lián)活化的抑制,q RT-PCR結(jié)果顯示CCR7、CD86、IL-1β、IL-6 m RNA的表達(dá)水平也受到明顯抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:LAIR-1的交聯(lián)活化對于IL-4所誘導(dǎo)M2極化相關(guān)分子CD163、CD206沒有明顯影響,但q RT-PCR結(jié)果則顯示91C3增加了CD163及CD206的m RNA表達(dá)水平,對于IL-10、Arginase-1的m RNA表達(dá)水平?jīng)]有影響�！窘Y(jié)論】首次證明LAIR-1的交聯(lián)活化可以明顯抑制巨噬細(xì)胞M1極化,表現(xiàn)為細(xì)胞表面共刺激分子、趨化因子受體表達(dá)減少,同時(shí)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生受到抑制。E.coli LPS、P.g LPS、TNF-α、IL-1β等與牙周炎發(fā)病相關(guān)致病因子及細(xì)胞因子都會造成巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子的表達(dá)急劇下降,與LPS處理過的HPDLF共培養(yǎng)也使得巨噬細(xì)胞表面LAIR-1的表達(dá)水平明顯的下降。但UPR狀態(tài)的HPDLF對于保持巨噬細(xì)胞表面LAIR-1分子的強(qiáng)度具有積極的意義,再次通過另一種機(jī)制解釋了UPR對于炎癥發(fā)展具有調(diào)節(jié)限制的作用。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4
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本文編號：2270169