【摘要】：目的本研究擬通過體外分離、培養(yǎng)及鑒定人乳牙牙髓干細(xì)胞后,探討二氫楊梅素對人乳牙牙髓干細(xì)胞的活性及成骨分化能力的影響,淺探二氫楊梅素與乳牙牙髓干細(xì)胞在治療牙周疾病中的可能性。方法1.采用組織塊法及有限稀釋法獲取人乳牙牙髓干細(xì)胞,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況,免疫熒光組織化學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物來鑒定細(xì)胞來源,CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線,并對細(xì)胞進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)分化;2.采用CCK-8法、堿性磷酸酶試劑盒及實時熒光定量PCR檢測0.02μM、0.1μM、0.5μM、2μM、10μM及50μM濃度的二氫楊梅素對人乳牙牙髓干細(xì)胞的活性及骨向分化能力的影響。結(jié)果1.鏡下觀察見細(xì)胞在第7 d左右從組織塊中爬出,細(xì)胞生長狀態(tài)良好;免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果為:第3代SHED波形絲蛋白在胞漿內(nèi)表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞CD146、CD105表達(dá)陽性,CD34、CD45表達(dá)陰性;第4代SHED生長曲線呈現(xiàn)“S”型;SHED成脂誘導(dǎo)3周后油紅O染色見細(xì)胞中有紅色脂滴形成;SHED成骨誘導(dǎo)4周后茜素紅染色形成紅染的礦化結(jié)節(jié)。2.二氫楊梅素對SHED細(xì)胞活性的影響CCK-8結(jié)果顯示:0.02μM、0.1μM、0.5μM、2μM、10μM及50μM濃度的二氫楊梅素在第24 h、48 h及72 h時與不含二氫楊梅素對照組相比,增值能力無顯著差異(P0.05),說明試驗設(shè)置的各濃度的二氫楊梅素對SHED無明顯的細(xì)胞毒性。3.二氫楊梅素對SHED成骨分化能力的影響⑴二氫楊梅素對SHED堿性磷酸酶活性的影響10μM及50μM濃度的二氫楊梅素組與對照組相比,可促進(jìn)SHED堿性磷酸酶的活性(P0.05);而0.02μM、0.1μM、0.5μM及2μM濃度的二氫楊梅素組的ALP活性與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。⑵二氫楊梅素對SHED RUNX2及OCN mRNA表達(dá)的影響RUNX2 mRNA表達(dá)結(jié)果為:0.5μM、2μM、10μM及50μM濃度的二氫楊梅素組RUNX2 mRNA的表達(dá)與對照組相比要高(P0.05);OCN mRNA表達(dá)變化為:2μM、10μM及50μM濃度的二氫楊梅素組與對照組相比,OCN mRNA的表達(dá)成上調(diào)趨勢(P0.05)。結(jié)論1.組織塊法及有限稀釋法可成功培養(yǎng)出人乳牙牙髓干細(xì)胞,人乳牙牙髓干細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下可向成骨及成脂方向分化;2.一定濃度的二氫楊梅素對人乳牙牙髓干細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性;3.一定濃度的二氫楊梅素可促進(jìn)人乳牙牙髓干細(xì)胞的骨向分化能力;4.本實驗為二氫楊梅素與人乳牙牙髓干細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用于牙周組織的再生提供了一定的參考價值,但其中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:Objective to investigate the effects of dihydromyricetin on the activity and osteogenic differentiation of human deciduous dental pulp stem cells after isolation, culture and identification in vitro. To explore the possibility of dihydromyricetin and deciduous dental pulp stem cells in the treatment of periodontal diseases. Method 1. Human deciduous dental pulp stem cells were obtained by tissue mass method and finite dilution method. The growth of human deciduous dental pulp stem cells was observed under inverted microscope. Immunofluorescence histochemistry and flow cytometry were used to detect the cell surface markers to identify the cell origin. CCK-8 method was used to draw the cell growth curve and adipogenic and osteogenic differentiation was carried out. CCK-8 assay, alkaline phosphatase kit and real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect the effects of 0. 02 渭 M 0. 1 渭 M, 0. 5 渭 M, 2 渭 M, 10 渭 M and 50 渭 M dihydromyricetin on the activity and osteogenic differentiation of human deciduous dental pulp stem cells. Result 1. It was observed that the cells crawled out of the tissue mass on the 7th day and the cells grew well. The results of immunofluorescence histochemistry showed that the third generation of SHED vimentin was positive in the cytoplasm, but the expression of keratin was negative. The positive expression of CD146 and CD105 was detected by flow cytometry, and the expression of CD34 and CD45 was negative. The growth curve of the fourth generation of SHED showed "S" type SHED lipid induction 3 weeks later, oil red O staining showed red lipid droplet formation in the cells after 4 weeks of osteogenesis induced by alizarin red staining to form a red-stained mineralized nodule .2. Effects of dihydromyricetin on the activity of SHED cells CCK-8 results showed that the concentrations of 0. 02 渭 M, 0. 5 渭 M, 0. 5 渭 M and 50 渭 M of dihydromyricetin were 10 渭 M and 50 渭 M at 24 h, 48 h and 72 h, respectively, compared with those of control group without dihydromyricetin. There was no significant difference in value-added ability (P0.05), which indicated that dihydromyricetin had no obvious cytotoxicity to SHED. Effects of dihydromyricetin on the osteogenic differentiation of SHED 1 the effects of dihydromyricetin on the activity of SHED alkaline phosphatase in 10 渭 M and 50 渭 M dihydromyricetin groups were compared with those in the control group. The activity of SHED alkaline phosphatase was enhanced (P0.05), while the ALP activity of the 0. 02 渭 M 0. 1 渭 M and 2 渭 M dihydromyricetin groups was not significantly different from that of the control group (P0.05). 2 the effect of dihydromyricetin on the expression of SHED RUNX2 and OCN mRNA was found to be 0. 5 渭 M 2 渭 M 10 渭 M and 50 渭 M respectively. The expression of RUNX2 mRNA in dihydromyricetin group was significantly higher than that in control group (P0.05). The expression of OCN mRNA in dihydromyricetin group (10 渭 M) and dihydromyricetin group (50 渭 M) was significantly higher than that in control group (P0.05). Conclusion 1. Human deciduous dental pulp stem cells could be successfully cultured by tissue block method and finite dilution method. Human deciduous dental pulp stem cells could differentiate into osteogenesis and adipogenesis under certain conditions. A certain concentration of dihydromyricetin has no obvious cytotoxicity to human deciduous dental pulp stem cells. A certain concentration of dihydromyricetin can promote the bone differentiation ability of human deciduous dental pulp stem cells. This experiment provides some reference value for the application of dihydromyricetin combined with human deciduous dental pulp stem cells in periodontal tissue regeneration, but the mechanism of its action needs further study.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：2169038