【摘要】：臨床上以純鈦或鈦合金為材料的牙種植體得到了廣泛應(yīng)用,但是由于天然鈦表面的氧化層較薄,在臨床上需要較長的愈合時間來獲得種植牙的成功,因此需要鈦表面改性技術(shù)來縮短種植牙愈合的時間和提高種植牙的成功率。目前,常用的一些表面處理技術(shù)包括羥基磷灰石涂層,噴砂、酸蝕、微弧氧化,紫外線光催化技術(shù)等等。多年來中外眾多學(xué)者做了大量的研究表明與光滑種植體表面相比,這些表面處理技術(shù)明顯改善了種植體的表面活性,促進(jìn)了種植體與骨的結(jié)合。然而眾多學(xué)者的研究中針對這些表面處理技術(shù)所采用的處理參數(shù)都各不相同。同一種表面處理技術(shù)在不同的處理參數(shù)條件下,得到的種植體表面性質(zhì)也各不相同,所以得出的實驗結(jié)果也不相同。長期以來由于缺少對同一種表面處理方法不同處理參數(shù)之間的對比研究,也就沒法確定出比較合適的處理參數(shù)。本實驗在設(shè)計之初發(fā)現(xiàn)這一問題之后,與材料學(xué)院相關(guān)專業(yè)進(jìn)行合作研究,針對同一種表面處理方法的不同處理參數(shù)進(jìn)行了大量的對比研究,得出了各種處理方法相對最適合的處理參數(shù),結(jié)論如下： 1、純鈦微弧氧化膜表面的微觀形貌、粗糙度、顯微硬度、膜重、膜厚、物相結(jié)構(gòu)、元素組成等隨著氧化時間不同呈現(xiàn)出相應(yīng)的改變,當(dāng)氧化20min時純鈦基體微弧氧化膜即生長完成。純鈦微弧氧化工藝模型分析表明其氧化膜微觀結(jié)構(gòu)、物相組成等與工藝參數(shù)之間存在必然的聯(lián)系。其中,微弧氧化工藝時間參數(shù)(t)是最主要的工藝參數(shù),膜層結(jié)構(gòu)及其他各參數(shù)都受工藝時間(t)的影響,工藝參數(shù)t決定了微弧氧化的加工時間。 2、噴砂純鈦基體表面在45s的噴砂時間呈現(xiàn)出一定微觀粗糙度與顯微硬度的較好組合。 3、氫氟酸和鹽酸混合溶液與基體鈦及其氧化層能夠發(fā)生酸蝕化學(xué)反應(yīng),影響了純鈦基體的微觀形貌及力學(xué)性能,酸蝕純鈦基體表面在90s的酸蝕時間組合了明顯的α+β復(fù)相組織結(jié)構(gòu)。 4、噴蝕對純鈦試樣主要產(chǎn)生了噴砂和腐蝕的綜合作用,純鈦基體經(jīng)過45s時間噴砂及120s的酸蝕預(yù)處理,試樣表面具有噴砂和酸蝕綜合作用效果,并去除了噴砂作用的殘留物。 在此結(jié)論的基礎(chǔ)上制定出了酸蝕、噴蝕、微弧氧化的最適處理參數(shù)如下： 1、空白對照組：商用二級純鈦板(TA2)切割成Φ3.O×10.0mm和Φ8.0×3.0mm的試件。依次以用SiC防水砂紙(320目、600目、800目、1200目)同方向逐級打磨至表面呈金屬光澤,表面劃痕一致。再依次以丙酮,無水酒精和去離子水超聲清洗15min(每步驟重復(fù)2次),常溫干燥。 2、酸蝕組參數(shù)：酸液：HF(40%)、HCI(38%)；比例：6：4；體積：40m1；溫度：室溫；時間：70s。； 3、噴砂+酸蝕組參數(shù)： (1)噴砂：：磨料：SiC；粒度：200m；氣壓：0.9MP；流量：2.10m/min；時間：40s；角度：70度；距離：：15cm；清洗：丙酮、去離子水清洗,電吹風(fēng)干； (2)酸蝕：：酸液：HF(40%)、HCI(38%)；比例：6：4；體積：40m1；溫度：室溫；.時間：l00s； 4、微弧氧化組參數(shù)：電壓：500V；頻率：550Hz：占空比：25%；電解液：30mmol/l (CH3C00)2Ca·H2O,10mmol/l C3H7Na206P.5H20,8mmol/1NaOH；溫度：低于40度；時間：18min； 在此參數(shù)條件下進(jìn)行本實驗研究。 1種植體表面處理 1.1研究目的 本實驗為了評估微弧氧化純鈦種植體生物學(xué)性能,運用“復(fù)合制備工藝設(shè)計+工藝條件優(yōu)化”的研究方法,在優(yōu)化了的條件下,采用酸蝕、“噴砂+酸蝕”(噴蝕)、微弧氧化表面處理方法對純鈦試樣進(jìn)行處理,以改善純鈦試樣的理化性能和生物活性等為目的,對于純鈦基體表面形貌、表面粗糙度及硬度、表面元素組成等方面進(jìn)行系統(tǒng)性深入分析,橫向?qū)Ρ攘怂嵛g、噴砂酸蝕及微弧氧化膜純鈦試樣的表面微觀結(jié)構(gòu)、物相組成、粗糙度及硬度等內(nèi)容,為后期的體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動物實驗做好材料準(zhǔn)備,為純鈦種植材料的開發(fā)提供實驗依據(jù)。 1.2研究方法： 由陜西寶雞金屬材料有限公司提供,選用TA2工業(yè)純鈦產(chǎn)品純鈦棒材制作試樣。材料的力學(xué)性能及化學(xué)成分等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)符合GB/T2956-2007要求。將純鈦棒材用數(shù)控線切割機床CNC分別加工成10.0mm厚度和3.0mm厚度的試樣,即得到①3.0×10.0mm和Φ8.0×3.0mm圓柱形TA2純鈦試樣。用180-600#金相砂紙分別將試樣表面磨光至表面微觀粗糙度Ra=0.2μmm,其中Φ8.0×3.0mm試樣用于試驗方案中種植體表面處理研究和體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗,Φ3.0×10.0mm只做為體內(nèi)動物試驗試樣。分組并分別對試樣進(jìn)行酸蝕、噴蝕、微弧氧化處理。掃描用電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscopy, SEM)觀察各組試件表面微形貌,X射線能譜儀(Energy DispersiveX-ray spectroscopy, EDS)檢測試件表面相對元素含量。用華銀HV-1000型數(shù)顯顯微硬度計測量試樣的顯微硬度值,用北京時代集團(tuán)生產(chǎn)的TIMETR200型粗糙度儀測試試樣表面微觀粗糙度Ra數(shù)值。所有結(jié)果使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計進(jìn)行單因素方差分析。 1：3實驗結(jié)論 1.3.1表面形貌(掃描電鏡結(jié)果) 空白組表面有砂紙打磨出較長且較淺的劃痕；酸蝕組純鈦基體明顯被腐蝕出許多平行的針狀溝痕,具有清晰的臺階和針狀顯微組織；噴蝕組純鈦基體表面除了保留有噴砂作用的切削痕跡外,被腐蝕出一些方向不同且成束的針片狀組成物,尤其是噴砂嵌入基體的殘余磨粒被腐蝕掉了,整個純鈦基體表面展現(xiàn)出噴砂與酸蝕復(fù)合作用的處理效果；微弧氧化膜組純鈦試樣基體表面呈現(xiàn)出凹凸不平均勻連續(xù)的氧化膜,氧化膜表面有較多的孔洞,多呈圓形橢圓形分布。MAO處理能使純鈦表面生成多孔疏松的膜層,其表面有類似于“骨小梁”的結(jié)構(gòu)。 1.3.2表面粗糙度 表面粗糙度發(fā)生變化,可以影響植體表面的動態(tài)接觸角,使材料的的親水性發(fā)生改變。經(jīng)過測試,光滑組打磨后的純鈦基體的Ra值是0.2μm；酸蝕處理后試樣粗糙度Ra達(dá)到1.08μm；噴蝕處理后試樣的粗糙度Ra為1.67μm；微弧氧化處理后試樣Ra值為1.68μm。 1.3.3表面硬度 通過檢測得純鈦基體的維氏硬度值是220HV0.025；酸蝕硬度達(dá)181HV0.025。噴蝕后硬度為259HV0.025；微弧氧化處理后的硬度為670HV0.025。說明微弧氧化膜具有較強的抗壓強度。 1.3.4純鈦基體表面元素組成 純鈦表面主要是鈦,占99.336%,其他元素的含量如下：鐵0.120%碳0.020%氮0.020%氫0.004%氧0.100%其他少于0.400%酸蝕組經(jīng)過HF、HCL雙重酸蝕后,能譜分析未見任何鋁、硅離子的污染,提示雙重酸蝕可完全去除包裹在鈦表面的A1203顆粒及Si02的污染,說明樣品表面污染物和氧化膜被去除干凈；噴蝕組當(dāng)腐蝕90s時試樣表面的Si,C元素相對含量分別減少為3.90%和4.81%；微弧氧化組各工藝階段試樣表面X射線能譜中的0, Ti元素的特征譜線峰值都比較強,試樣表面的EDS譜還顯示了氧化膜中Ca,P元素的特征譜線。微弧氧化工藝處于18min時,試樣氧化膜中的Ca元素的相對含量為11.25-9.93%,P元素含量為3.04～2.68%,因為純鈦微弧氧化膜物相分析中除發(fā)現(xiàn)少量Ca3(P04)2外,無其他含Ca,P元素的化合物存在,說明有些Ca,P元素或以離子態(tài)或非晶態(tài)存在于微弧氧化膜中。 2.體外細(xì)胞培養(yǎng) 本實驗通過掃描電鏡、倒置顯微鏡,應(yīng)用胎牛血清,ST2細(xì)胞,在處理后的4組Φ8.OX3.0mm的純鈦試件上進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng),研究不同的表面處理的純鈦試件表面理化性能及生物活性的變化。 2.1試驗分組及方法 2.1.1試樣分組： A、空白對照B、酸蝕C、噴蝕D、微弧氧化 2.1.2取出液氮中保存的細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇,細(xì)胞傳代,開始進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)； 2.1.3對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行接種 觀察ST2細(xì)胞在純鈦表面的黏附情況,進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察、計數(shù)；研究四種純鈦試樣對ST2細(xì)胞增殖功能影響的檢測；研究四種試樣對ST2細(xì)胞分化功能影響的檢測,分別測定堿性磷酸酶的活性,骨鈣素的含量——ELISA的檢測； 2.2試驗結(jié)果 2.2.1、細(xì)胞毒性試驗 根據(jù)MTT法測定的OD值計算相對增值率(RGR),細(xì)胞相對增值率RGR%=OD實驗組/OD陰性對照組X100%。根據(jù)不同時期各組RGR值進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(CTS)。由本實驗結(jié)果可知：四組純鈦試樣浸提液與陰性對照組比較均無差異顯著(P0.05),CTS分級均為0級,說明本研究所采用的純鈦種植體無毒性,符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.1—2001》中對材料細(xì)胞毒性的要求。 2.2.2ST2細(xì)胞黏附實驗----形態(tài)學(xué)觀察、計數(shù) 細(xì)胞粘附是細(xì)胞增殖及分化的前提,細(xì)胞的早期附著與種植材料的表面形貌、化學(xué)成分有密切的關(guān)系。鏡下可見空白組表面細(xì)胞胞體較扁平,長軸與表面溝紋方向一致,表面初步伸出絲狀偽足和板狀偽足,數(shù)目較少。酸蝕組表面細(xì)胞呈紡錘體狀,中央胞核較飽滿,可見板狀偽足,深入孔洞內(nèi)。噴蝕組表面細(xì)胞呈梭形,表面呈現(xiàn)很多絲狀偽足和板狀偽足突起,放射狀伸入周圍孔洞內(nèi)。微弧氧化組表面細(xì)胞呈樹突狀,中央胞核較飽滿,可見板狀偽足深入孔洞內(nèi),表面大部分細(xì)胞附著在圓滑形凹陷內(nèi),絲狀偽足較好的附著在表面孔洞的邊緣,伸展較好。部分細(xì)胞還伸展出板狀偽足,表現(xiàn)出較典型的多角形。MAO處理后樣品表面形成富含鈣磷的疏松多孔結(jié)構(gòu),增加了粗糙度,有利于材料對蛋白的吸附并介導(dǎo)細(xì)胞附著。 2.2.3細(xì)胞增殖 根據(jù)MTT實驗原理,OD值越大在培養(yǎng)的初期就說明粘附于鈦片表面的活細(xì)胞越多；在培養(yǎng)后期則表示鈦片表面增殖的細(xì)胞越多。因此MTT實驗根據(jù)時間點的不同分別說明了不同表面處理的純鈦試樣表面對細(xì)胞的初期附著和后期增殖的影響。培養(yǎng)后的3、5和7天,細(xì)胞生長曲線說明了對純鈦基體表面進(jìn)行優(yōu)化表面處理后有利于細(xì)胞增殖。 培養(yǎng)第1、3、5和7d后,B、C和D組時間表面成骨細(xì)胞的增殖比A組好。第1天,各組的增值情況相差不多,無明顯差異。第3,第5和第7天,同一時間點上,D組均是高于B,C與A組,其差異存在統(tǒng)計學(xué)意義,p0.5,但是B組和C組之間無明顯差異,p0.05,不存在統(tǒng)計學(xué)意義�？偟膩碚f,增殖的總趨勢是：DB=CA,B、C組之間不存在統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2.4細(xì)胞的分化 2.2.4.1四組純鈦試樣對ST2細(xì)胞ALP活性的檢測 細(xì)胞分化的標(biāo)志主要表現(xiàn)為較高的ALP活性,合成I型膠原,表達(dá)骨鈣素(OC)和骨橋蛋白。細(xì)胞層內(nèi)高水平的ALP活性能促進(jìn)礦化組織的形成,加快骨形成。ALP的表達(dá)與細(xì)胞的分化有關(guān),ALP的活性水平代表了細(xì)胞的分化程度。本實驗中,對組試件表面ST2細(xì)胞ALP活性進(jìn)行比較,在培養(yǎng)后的第3、5、7天后,可看到同時期內(nèi)微弧氧化處理后的純鈦試件的ALP含量均處最高水平,B、C、D三組處理表面ALP含量都高于A組,且(p0.5)存在統(tǒng)計學(xué)意義,B組優(yōu)于C組但無統(tǒng)計學(xué)意義；D組明顯優(yōu)于B組和C組,(p0.5),其差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2.4.2四組純鈦試樣對ST2細(xì)胞OC8含量的影響 分析四組純鈦試樣對于ST2細(xì)胞分泌OCN的ELISA檢測結(jié)果,各組OCN的濃度都隨著時間而不斷升高。在每個檢測時間點,B、C和D組OC的合成均高于A組(p0.05),D組的OC合成比B、C的高(p0.05),總的高低趨勢為DCBA。 3、動物實驗 3.1實驗方法 優(yōu)化處理后試樣種植體分為4組：A組(空白對照)、B組(酸蝕)、C組(噴蝕)、D組(微弧氧化)。優(yōu)選24只新西蘭兔,雌雄不拘,身體狀況良好,平均體重在2.5——3kg。將新西蘭兔隨機分為甲、乙兩組。在甲組近心端植入A、B兩種試樣,遠(yuǎn)心端植入C、D兩種試樣；在乙組近心端植入C、D兩種試樣；遠(yuǎn)心端植入A、B兩種試樣。術(shù)后4周從甲、乙兩組中隨機各抽取一半的新西蘭兔處死獲取標(biāo)本；8周后處死甲乙兩組的另一半新西蘭兔獲取標(biāo)本。取材后采用X線片檢測、骨結(jié)合力實驗、5倍顯微鏡下觀、組織學(xué)觀察對標(biāo)本進(jìn)行生物學(xué)性能分析。 3.2實驗結(jié)果 3.2.1術(shù)后觀察 新西蘭兔生長狀況良好,所有種植釘(96枚)均未發(fā)生松動,脫落,存留完好,種植體與骨結(jié)合良好,部分種植釘頂部被骨皮質(zhì)覆蓋。種植體周圍軟組織未見感染、化膿、壞死；4周時,骨一種植體之間結(jié)合良好,種植體靠近骨髓腔的一面有新骨形成,8周時可以看到骨與種植體直接連接,沒有看到間隙存在。標(biāo)本取樣后X線片顯示,種植體植入方向和位置適當(dāng),種植體在兔股骨皮質(zhì)骨和髓腔內(nèi),形成良好骨結(jié)合。5倍顯微鏡下可見植體與骨組織界面,空白對照組可見種植體周圍骨質(zhì)相對稀松,種植體表面可見骨組織接觸較少,偶見間隙,B、C、D組植體周圍骨質(zhì)相對致密,種植體表面可見骨組織接觸較多。微弧氧化組鏡下顯示種植體與骨組織緊密嵌合無縫隙長入。 3.2.2頂出實驗結(jié)果 4周、8周測試時間點,骨-種植體界面抗剪切強度表現(xiàn)為ABCD,B、C、D與A組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),試驗組中B、C組與D組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),B組與C組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05), 3.2.3組織學(xué)結(jié)果(不脫鈣硬組織切片,HE染色) 4周時,可見純鈦組界面主要為結(jié)締組織和類骨質(zhì)成分為主,只有少量新骨形成,而微弧氧化組可見較多骨小梁形成,新生的骨小梁邊緣可見大量單層排列的低柱狀成骨細(xì)胞,8周時,純鈦組界面處可見少量的骨小梁,以編織骨為主,也可見大量的類骨質(zhì)和結(jié)締組織共存,大量成骨細(xì)胞排列于新生骨周圍,成骨較活躍。微弧氧化組8周時,界面大部分由骨組織構(gòu)成,部分骨小梁已逐漸融合成不規(guī)則的密質(zhì)骨,新骨周圍仍可見大量的單層排列成骨細(xì)胞。 硬組織切片實驗發(fā)現(xiàn),酸蝕與噴蝕組鈦種植體周圍骨結(jié)合情況相近,兩組的BIC值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,空白組中BIC明顯降低,與之相反,微弧氧化組BIC明顯升高,與A、B、C組的差異有統(tǒng)計學(xué)的意義(P0.05)。 4、結(jié)論 1、酸蝕、噴砂+酸蝕、微弧氧化三種表面處理工藝均能不同程度改變純鈦種植體的理化性質(zhì),提高其生物學(xué)性能。 2、噴蝕呈現(xiàn)出噴砂加酸蝕的復(fù)合效應(yīng),生物學(xué)性能優(yōu)于單獨酸蝕處理。 3、微弧氧化處理后的種植體的生物學(xué)性能優(yōu)于酸蝕和噴蝕處理,多種表面處理工藝的復(fù)合研究將成為未來種植體表面優(yōu)化處理的新熱點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R783

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2150592