【摘要】：目的探討過量全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,at RA)小鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。方法取周齡為10周左右的SPF級(jí)C57BL/6J近交系小鼠(雌鼠40只,雄鼠20只),于前一天晚8時(shí)按雌雄比2:1進(jìn)行合籠交配。以次日早晨觀察到陰栓陽性的雌鼠標(biāo)記為妊娠0天(gestation day 0,GD0),共獲得30只孕鼠,隨機(jī)分組后,每組15只。在GD10時(shí),實(shí)驗(yàn)組以一次性灌胃給藥的方式給予孕鼠100mg/kg的at RA,對(duì)照組孕鼠灌以等量玉米油。分別取兩組GD13、14、15和16時(shí)灌胃時(shí)點(diǎn)的胎鼠標(biāo)本,利用HE染色連續(xù)觀察胎鼠腭板發(fā)育情況。我們建立GD13胎鼠腭突間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型,利用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第三代胎鼠腭間充質(zhì)(mouse embryonic palate mesenchymal,MEPM)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),根據(jù)at RA作用濃度,實(shí)驗(yàn)共分為5組(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L),并設(shè)空白對(duì)照組。at RA作用時(shí)間分別為:24h、48h和72h。利用臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT法檢測(cè)at RA對(duì)MEPM細(xì)胞活性的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系,由此結(jié)合RA的臨床藥理特點(diǎn),選擇適宜的時(shí)間和濃度,進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。利用Real-time PCR檢測(cè)過量at RA對(duì)Smad2、Smad7 m RNA表達(dá)的影響,Western blot方法檢測(cè)過量at RA對(duì)MEPM細(xì)胞內(nèi)蛋白Smad2、Smda7和p-Smad2蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為雙側(cè)α=0.05。結(jié)果HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對(duì)照組GD13、14、15和16胎鼠雙側(cè)腭板完成上抬、接觸及融合過程;而與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組GD13胎鼠雙側(cè)腭板體積較小,且并未觀察到雙側(cè)腭板上抬;GD14時(shí),實(shí)驗(yàn)組胎鼠雙側(cè)腭板未上抬,可觀察到發(fā)育明顯延遲;GD15時(shí),實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)腭板仍未發(fā)生接觸,最終在GD16時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組胎鼠兩側(cè)腭板形成腭裂。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,隨at RA作用時(shí)間及濃度增加細(xì)胞拒染率逐漸降低,提示隨at RA作用時(shí)間及濃度增加,細(xì)胞活性逐漸下降;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:at RA濃度在0.1-10μmol/L范圍內(nèi),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),MEPM細(xì)胞吸光度值為遞減趨勢(shì),MEPM細(xì)胞活性隨著at RA濃度增加細(xì)胞活性逐漸下降,尤其是加藥72小時(shí)后,細(xì)胞增殖明顯受到抑制,并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。我們利用SPSS 17.0分析得到at RA作用72小時(shí)對(duì)MEPM細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為:4.76μmol/L。實(shí)時(shí)定量Real-time PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比,實(shí)驗(yàn)組(5μmol/L at RA)可促進(jìn)Smad7m RNA的表達(dá)(P0.05),而對(duì)Smad2 m RNA表達(dá)無影響(P0.05);Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,5μmol/L at RA可下調(diào)p-Smad2蛋白的表達(dá),促進(jìn)Smad7蛋白表達(dá),但對(duì)Smad2蛋白表達(dá)并無影響(P0.05)。結(jié)論(1)體外培養(yǎng)條件下,at RA在一定范圍內(nèi)可抑制小鼠胚胎腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。(2)過量at RA通過下調(diào)TGF-β/Smad途徑信號(hào)分子的正常表達(dá)影響小鼠胚胎腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖,這可能是at RA誘發(fā)腭裂的生物學(xué)機(jī)制之一。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of excessive all-trans retinoic acidat RA on the proliferation of palatal mesenchymal cells and its mechanism. Methods SPF C57BL / 6J inbred mice (40 female and 20 male) aged about 10 weeks were selected for cage mating at 8 pm on the previous day. A total of 30 pregnant mice were randomly divided into three groups, 15 in each group. At the time of GD10, the experimental group was given the same amount of corn oil as the pregnant rat 100mg/kg at RAA by one dose of intragastric administration, while the control group was given the same amount of corn oil. The fetal mouse at the time of gavage of GD1314 and 16:00 were used to observe the development of palatal plate of fetal mice by HE staining. We established the primary culture model of GD13 fetal mouse palatal process mesenchymal cells (GD13), and used the third generation fetal mouse palatal mesenchymal cells (mouse embryonic palate mesenchymal The experiment was divided into five groups (0.1 渭 mol / L, 0.5 渭 mol / L, 1 渭 mol / L, 5 渭 mol / L, 10 渭 mol / L, respectively). Trypan blue MTT assay was used to detect the time-effect and dose-effect relationship of ATRA on MEPM cells. According to the clinical pharmacological characteristics of RA, appropriate time and concentration were selected for further experiments. Real-time PCR was used to detect the effect of excessive at RA on the expression of Smad2 Smad7 mRNA. Western blot was used to detect the effect of excessive at RA on the expression of Smad2 Smad7 and p-Smad2 proteins in MEPM cells. The statistical software SPSS 17.0 was used to analyze the results of this experiment. The test level was 0. 05 for both sides. Results the results of HE staining showed that the bilateral palatal plates in the control group were raised, contacted and fused with GD1314 and 16 fetal mice, while the bilateral palatal plates of the GD13 fetal mice in the experimental group were smaller than those in the control group, and the bilateral palatal plates were not observed when the bilateral palatal plates were lifted up and GD14 was not observed in the experimental group. The bilateral palatal plate was not raised in the experimental group, and the development of GD15 was delayed obviously, and the bilateral palatal plate was not contacted in the experimental group. Finally, cleft palate was observed in the bilateral palatal plate of the experimental group at GD16. The results of trypan blue staining showed that the cell rejection rate decreased with the increase of ATRA concentration and time, suggesting that the cell activity decreased with the increase of ATRA concentration. The results of MTT assay showed that the concentration of at RA was in the range of 0.1-10 渭 mol / L. The activity of MEPM cells decreased with the increase of ATRA concentration, especially after 72 hours, the proliferation of MEPM cells was inhibited in a dose-dependent manner. By SPSS 17.0 analysis, we obtained that the half inhibitory concentration of ATRA on MEPM cells was: 1: 4.76 渭 mol / L for 72 hours. The results of real-time PCR showed that 5 渭 mol / L atRA could promote the expression of Smad7m RNA (P0.05), but had no effect on the expression of Smad2 mRNA (P0.05). The results of Western blot showed that 5 渭 mol / L tat RA could down-regulate the expression of p-Smad2 protein compared with the control group. Promote the expression of Smad7 protein, but have no effect on the expression of Smad2 protein (P0.05). Conclusion (1) the proliferation of mouse embryonic palate mesenchymal cells can be inhibited in a dose-dependent manner under the condition of culture in vitro. (2) excessive atRA can affect the proliferation of mouse embryonic palate mesenchymal cells by down-regulating the normal expression of TGF- 尾 / Smad signaling molecule. This may be one of the biological mechanisms of cleft palate induced by at RA.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782.2

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本文編號(hào)：2136470