本文選題：軟骨細胞 + 脂肪干細胞��； 參考：《吉林大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：軟骨一旦損傷便無法自行修復(fù)，組織工程的興起為解決這一難題提供了新的方法。脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）因來源豐富，取材方便且創(chuàng)傷小等優(yōu)點而成為軟骨組織工程理想的種子細胞，然而目前并沒有一種公認高效的誘導(dǎo)方法。傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法用到大量的生長因子如TGF-βs、BMPs等,費用高半衰期短，而且避免不了在ADSCs發(fā)生穩(wěn)定軟骨向分化的同時發(fā)生早期肥大。已知正常關(guān)節(jié)軟骨微環(huán)境可以誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細胞分化，因此近年來利用ADSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)ADSCs向軟骨分化的研究越來越多，但共培養(yǎng)的機制及兩種細胞的最佳比例有待進一步探討。 研究目的：本研究的目的有兩個：（1）通過Transwell間接共培養(yǎng)ADSCs與軟骨細胞，得出能夠使被誘導(dǎo)的ADSCs最大程度的表達軟骨特異性細胞外基質(zhì)，同時使Col-Ⅹ等軟骨肥大化標志無明顯上調(diào)時ADSC與軟骨細胞的比例；（2）比較生長因子誘導(dǎo)與共培養(yǎng)誘導(dǎo)對ADSCs發(fā)生軟骨向分化的差別。 研究方法:1、ADSCs和軟骨細胞的分離培養(yǎng)及鑒定：無菌取2-4周齡新西蘭白兔腎周脂肪，Ⅰ型膠原酶消化后，結(jié)合差速貼壁法分離提純干細胞(ADSCs)，傳至第3代，分別進行成骨、成脂誘導(dǎo)并通過茜素紅，，油紅O染色鑒定誘導(dǎo)結(jié)果。取膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)Ⅱ型膠原酶過夜消化，離心收集體外擴增，阿利新蘭染色鑒定結(jié)果。2、ADSCs和軟骨細胞微球的制備：分別以5xl05個細胞制備微球，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3天后共培養(yǎng)。3、ADSCs和軟骨細胞的共培養(yǎng)及分組：將ADSCs和軟骨細胞微球分置于孔徑為0.4μm的Tranwell的上下層，建立共培養(yǎng)體系，實驗共分為9組：組1為單純下層的軟骨細胞球，作為陽性對照組1，用普通培養(yǎng)基（H-DMEM，1％ITS，40μg/ml的L-脯氨酸，50μg/ml抗壞血酸，1％青/鏈霉素，2.5μg/ml兩性霉素B）培養(yǎng)；組2為單純上層的ADSCs球，培養(yǎng)方式同組1，為陰性對照組；組3為單純上層的ADSCs球，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基（比普通培養(yǎng)基多加了10ng/ml TGF-β3+10ng/ml BMP-6+0.1mM地塞米松）培養(yǎng)，為陽性對照組2。組4到組9為實驗組，為將ADSCs球和軟骨細胞球以不同比例（0.5:1;1:1;1:2;1:3;1:5;1:7）共培養(yǎng)，培養(yǎng)方式為同組1和組2。共培養(yǎng)28天后分別行組織形態(tài)學(xué)觀察，COL-Ⅱ、COL-Ⅹ和GAG蛋白水平的定性定量檢測。 研究結(jié)果：1、提取的ADSCs增殖迅速，原代呈集落樣生長,傳代后多為長梭形，排列規(guī)則，呈漩渦狀。多向分化誘導(dǎo)后油紅O染色脂滴呈紅色、茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)呈深粉紅色；培養(yǎng)的透明軟骨貼壁迅速，生長良好，輪廓清楚，阿利新藍染色呈典型的軟骨細胞形態(tài)，胞漿呈藍色。2、Transwell微球共培養(yǎng)28天后，阿利新藍及Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示除了陰性對照組外，各組結(jié)果均為陽性，然而相比于陽性對照組1的強陽性表現(xiàn)，比例為0.5:1和1:1的兩組陽性較弱。Ⅹ型膠原在各組均表現(xiàn)為陽性，但在生長因子對照組的陽性表達最為強烈，超過了任何一個共培養(yǎng)組。通過二甲基亞甲藍分光光度法(DMMB法)檢測誘導(dǎo)后的ADSCs的總GAG含量結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，總GAG含量在共培養(yǎng)組均有所增加，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），且增加量與軟骨細胞的比例呈正相關(guān)，但是在ADSC：AC比例達到1:5之后反而有所下降。通過羥（基）脯氨酸檢測（Hydroxyprogesterone，OHP）到的總膠原蛋白的變化類似于GAG的變化。組8（ADSC：AC為1:5）的總膠原量較其他共培養(yǎng)組均較高，甚至達到了陰性對照組的7.3倍。 研究結(jié)論：1、分離的ADSCs具有成脂（油紅O染色陽性）、成骨（茜素紅染色陽性）和成軟骨（甲苯胺藍染色陽性）的能力；2、ADSCs與軟骨細胞通過Transwell間接共培養(yǎng)可以使ADSCs發(fā)生軟骨向分化，兩種細胞不同比例對ADSCs分化成軟骨細胞的能力及新生軟骨的性狀影響較大，能夠使被誘導(dǎo)的ADSCs最大程度的表達軟骨特異性細胞外基質(zhì)的最佳比例為1:5；3、共培養(yǎng)誘導(dǎo)較生長因子誘導(dǎo)能夠抑制ADSCs軟骨向分化后的肥大問題（COL-Ⅹ表達減少）。
[Abstract]:Adipose - derived stem cells ( ADSCs ) are the ideal seed cells for cartilage tissue engineering .

The aim of this study was as follows : ( 1 ) ADSCs and chondrocytes were co - cultured indirectly through Transwell , and the maximum expression of cartilage - specific extracellular matrix could be expressed in the induced ADSCs , while the ratio of ADSCs to chondrocytes was increased when the signs of cartilage hypertrophy such as Col - X were not up - regulated ;
( 2 ) Comparative growth factor - induced and co - culture induced differentiation of ADSCs into chondrogenic differentiation .

Methods : 1 . Isolation , culture and identification of 1 , ADSCs and chondrocytes : After 2 - 4 weeks old New Zealand white rabbits were isolated and purified by differential adherent method . The results were as follows : 1 . The ADSCs and chondrocytes were cultured for 2 - 3 days . The results were as follows : 1 . The ADSCs and chondrocytes were cultured in normal medium ( H - DMEM , 1 % ITS , 40 渭g / ml L - proline , 50 渭g / ml ascorbic acid , 1 % green / streptomycin , 2.5 渭g / ml ) .
Group 2 was only the upper layer of ADSCs , and the culture method was similar in group 1 , which was negative control group .
Group 3 was isolated from the upper layer of ADSCs and cultured with an induction medium ( more than 10 ng / ml TGF - 尾3 + 10 ng / ml BMP - 6 + 0.1 mM dexamethasone ) in the culture medium . In order to co - culture ADSCs and chondrocytes in different proportions ( 0.5 : 1 ; 1 : 1 ; 1 : 2 ; 1 : 3 ; 1 : 5 ; 1 : 7 ) , the morphological observation , COL - 鈪

本文編號：1943052