本文選題：舌鱗癌 + 1ncRNA��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：口腔頜面部頭頸癌是我國主要的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居全身癌的第六位,舌鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,其中局部的浸潤復(fù)發(fā)、頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是舌鱗癌預(yù)后不良的首要原因。盡管舌鱗癌的綜合治療措施在不斷的發(fā)展完善,但一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,其治療仍不能獲得滿意效果,早期舌鱗癌5年生存率可達(dá)70%,而晚期舌鱗癌5年生存率僅為30%。因此,加強(qiáng)對舌鱗癌發(fā)生發(fā)展病因、機(jī)制的基礎(chǔ)研究,闡明舌鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,對舌鱗癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)行預(yù)測、早期診斷和預(yù)后判斷是舌鱗癌研究的前沿課題,對于提高舌鱗癌治愈率、減少死亡率具有重要的科學(xué)意義。 研究表明在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中,發(fā)揮作用的除了行使執(zhí)行功能的蛋白分子外,RNA也在其中發(fā)揮重要功能,最近的研究識別了一些與癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志分子包括蛋白編碼基因和miRNAs。 RNA不僅僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的信息橋梁,而且在機(jī)體的多種生命活動中發(fā)揮著重要作用。其中非編碼RNA在生命過程中扮演著不同的重要角色,如功能已被廣泛認(rèn)可的tRNA、miRNA等。最近的研究顯示在許多組織異常表達(dá)的長鏈非編碼RNAs (long noncoding RNAs, IncRNAs)通過特定的癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。 長鏈非編碼RNA (lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子,它們并不直接參與蛋白質(zhì)的編碼,起初一直被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的γ噪音”,是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,并不具備生物學(xué)功能。但由于哺乳動物染色體轉(zhuǎn)錄的RNA數(shù)量龐大,而編碼蛋白質(zhì)的mRNA只有2%左右,另外剩余大量的非編碼RNA除了我們所熟悉的miRNA,siRNA等外,還存在著大量的尚未被認(rèn)知的lncRNAs,在腫瘤學(xué)研究中,lncRNA異常表達(dá)主要表現(xiàn)以下三個方面：一是一些lncRNA可能僅僅在某些腫瘤中呈特異性表達(dá),如DD3在前列腺癌中的特異性表達(dá)；二是很多IncRNA不僅僅在一種腫瘤中呈過表達(dá)(如MALAT1在肺癌、腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中均存在過表達(dá))；三是一些腫瘤中可能不止一種lncRNA呈過表達(dá)[例如在前列腺癌中PCGEM1, DD3(PCA3), PCAF1均發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常]。另外,研究發(fā)現(xiàn)IncRNAs與肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如MALAT1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,HOTAIR在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。愈來愈多的研究證實(shí)IncRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。 目前l(fā)ncRNA的研究仍處于起步階段,由于lncRNA功能復(fù)雜多樣,既存在促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的促癌因子,也存在抑制腫瘤生長的抑癌因子,目前對IncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色和功能作用等仍不明確。我們對lncRNA功能的深入研究將為其在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用帶來全新的認(rèn)識。 隨著人類基因組內(nèi)越來越多的lncRNA被鑒定出來,人們發(fā)現(xiàn)lncRNA所介導(dǎo)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著數(shù)量眾多的編碼基因,因此lncRNA在腫瘤學(xué)研究中具有重要價值,尋找IncRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調(diào)控和腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的重要分支和熱點(diǎn)。因此lncRNA在惡性腫瘤中的特征性表達(dá)譜使其有望成為新的腫瘤診斷及預(yù)后評估的生物學(xué)指標(biāo),而異常表達(dá)的lncRNA也可直接或間接調(diào)控靶基因,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程。截至目前,IncRNA在口腔腫瘤中的研究鮮見報道,因此,對IncRNA的表達(dá)譜及其對基因調(diào)控的作用機(jī)制研究也為舌鱗癌的相關(guān)研究增添了一個新的切入點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)分為以下三部分： 第一章舌鱗癌組織與正常舌組織差異表達(dá)IncRNAs的篩選 研究目的： 本研究利用微矩陣基因芯片技術(shù),研究IncRNA在舌鱗癌組織和正常舌組織之間表達(dá)譜的差異,探討IncRNA在基因調(diào)控中可能存在的作用,并初步探討IncRNA和舌鱗癌之間的關(guān)系。 研究方法： 1.隨機(jī)選取3例舌鱗癌組織和3例正常舌組織分別設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組(舌鱗癌組織組)和對照組(正常舌組織組)。隨后對選取的6例組織標(biāo)本進(jìn)行處理,抽提總RNA,然后對提取所得的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測； 2.對質(zhì)量檢測符合納入標(biāo)準(zhǔn)的組織樣本,合成cDNA,完成基因芯片雜交,對雜交芯片采取Agilent Microarray Scanner軟件進(jìn)行掃描,然后用Feature Extraction software10.7軟件對掃描所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,再用Gene Spring Software11.0軟件對前述結(jié)果進(jìn)行歸一化處理,最后得到mRNA和IncRNA數(shù)據(jù)； 3.采用折疊倍率(Fold Change)法進(jìn)行差異基因篩選。首先設(shè)定差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn),以Fold Change2,p0.05作為差異基因納入標(biāo)準(zhǔn),獲得差異mRNAs和IncRNAs表達(dá)譜,并通過散點(diǎn)圖(Scatter Plot)和火山圖(Volcano Plot)對差異mRNAs和IncRNAs直觀標(biāo)示,然后再采用軟件Gene Spring Software11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。 研究結(jié)果： 1.以實(shí)驗(yàn)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)作為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)(Fold Change2,p0.05),芯片篩選的結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組不同的組織芯片中,mRNAs和IncRNAs的表達(dá)譜有明顯差異,其中差異mRNAs有2696個,差異IncRNAs有3590個；2.在篩選所得的差異mRNAs2696個中,上調(diào)的mRNAs有1888個,下調(diào)的mRNAs有808個,上調(diào)的mRNAs明顯高于下調(diào)的mRNAs。其中NM_002425是上調(diào)倍數(shù)最大的mRNA,上調(diào)倍數(shù)為3443.299,NM_033185是下調(diào)倍數(shù)最大的mRNA,下調(diào)倍數(shù)為142.1286250966048； 研究結(jié)論： 1. IncRNA microarray基因芯片是篩選舌鱗癌差異表達(dá)基因的一種高通量、高效率檢測手段； 2.首次利用IncRNA microarray基因芯片研究舌鱗癌的IncRNA基因表達(dá)譜,經(jīng)Microarray基因芯片檢測,對實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組基因表達(dá)譜進(jìn)行相比,差異IncRNAs有3590個,上調(diào)的IncRNAs有1785個,下調(diào)的IncRNAs有1805個；同時檢測到有2696個mRNAs表達(dá)有差異,其中上調(diào)表達(dá)1888個,下調(diào)表達(dá)808個。這提示IncRNA可能是全新的舌鱗癌標(biāo)記物和潛在的基因治療靶點(diǎn)。 第二章舌鱗癌組織與正常舌組織差異表達(dá)IncRNAs的實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 研究目的： 我們通過基因芯片對差異基因進(jìn)行篩選,表明實(shí)驗(yàn)所采用的IncRNA microarray基因芯片是一種高通量、高效率的檢測手段,并且依據(jù)基因芯片篩選得到若干差異表達(dá)的IncRNAs,為進(jìn)一步明確該芯片的準(zhǔn)確性,我們從上調(diào)和下調(diào)的若干IncRNAs中分別隨機(jī)挑選出3個IncRNAs在50例舌鱗癌組織和15例正常舌組織以及4種舌鱗癌細(xì)胞和1種正常舌細(xì)胞中進(jìn)行SYBRGREEN I實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗(yàn)證(3個上調(diào)的IncRNAs:uc002ect, NR_026800,LIT1923,3個下調(diào)的IncRNAs:THC2631745, ENST00000494340, NR_027044.1),以進(jìn)一步明確IncRNA microarray基因芯片的準(zhǔn)確性。 研究方法： 對挑選的3個上調(diào)的IncRNAs和3個下調(diào)的IncRNAs在50例舌鱗癌組織和15例正常舌組織以及4種舌鱗癌細(xì)胞和1種正常舌細(xì)胞中采用RT-PCR驗(yàn)證,并用GAPDH做內(nèi)參。 研究結(jié)果： 結(jié)果表明,對挑選的6個IncRNAs采用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,RT-PCR結(jié)果在舌鱗癌組織和舌鱗癌細(xì)胞中顯示uc002ect,NR_026800,LIT19233個基因表達(dá)上調(diào),THC2631745,ENST00000494340,NR_027044.13個基因表達(dá)下調(diào)，和前面實(shí)驗(yàn)中基因芯片所篩選的結(jié)果基本吻合。 研究結(jié)論： 1. IncRNAs (uc002ect, NR_026800, LIT1923,THC2631745, ENST00000494340, NR_027044.1)在舌鱗癌組織和細(xì)胞中存在差異表達(dá),提高了芯片結(jié)果的可信度； 2.進(jìn)一步表明IncRNA microarray基因芯片是一種高通量的、高效率的檢測手段,是篩選舌鱗癌差異表達(dá)基因的一種理想有效的方法。 第三章舌鱗癌組織與正常舌組織差異表達(dá)lncRNAs的生物信息學(xué)研究 研究目的： 初步探討實(shí)驗(yàn)組和對照組中差異表達(dá)的lncRNAs在基因調(diào)控中可能發(fā)揮的作用,并通過利用生物信息學(xué)手段研究分析差異表達(dá)的lncRNAs在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用。 研究方法： 綜合NCBI RefSeq、 NCBI Other、 UCSC、ENSEMBL、 Homolog、 LNCRNA-DB ncRNA-SCAN、 Agilent-G3、 Agilent Other及Other Database等多個數(shù)據(jù)庫的資源,對芯片的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析(Gene Ontology、 Pathways分析等),并通過計(jì)算差異表達(dá)的mRNAs和IncRNAs Pearson之間的相關(guān)系數(shù)構(gòu)建IncRNA與mRNA的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。研究結(jié)果： GO (Gene Ontology)分析顯示：生物學(xué)進(jìn)程(biological process,BP)方面,差異表達(dá)的mRNAs主要富集在11個生物學(xué)進(jìn)程中,其中排第一的是immune system process這一生物學(xué)進(jìn)程,含有差異表達(dá)基因215個,占該進(jìn)程中所有基因數(shù)的1.3%。排在第二、第三的生物學(xué)進(jìn)程分別為locomotion和biologicaladhesion,分別包含差異基因數(shù)為91和219,分別占各自所在生物學(xué)進(jìn)程中所有基因數(shù)的比例為0.5%和0.8%；在細(xì)胞組件(cellular component, CC)方面,差異表達(dá)的mRNA基因主要富集在12個細(xì)胞組件中,其中排第一的是extracellular region part這一細(xì)胞組件,含有差異表達(dá)基因197個,占該細(xì)胞組件中所有基因數(shù)的1.2%。排在第二、第三的細(xì)胞組件分別為extracellular space和extracellular matrix,分別含差異基因數(shù)為141和74,分別占各自所在細(xì)胞組件中所有基因數(shù)的比例為0.8%和0.4%；在分子功能(molecular fimction, MF)當(dāng)中,差異表達(dá)的mRNA基因主要富集在11個分子功能中,其中排第一的是signal transducer activity這一分子功能,含有差異表達(dá)基因296個,占該分子功能中所有包含基因數(shù)的1.8%。排在第二、第三的分子功能分別為extracellular matrix structural constituent和carbohydrate binding,分別含差異基因數(shù)為24和61,分別占各自所在分子功能中所有基因數(shù)的比例為0.1%和0.4%。 通過KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)的mRNA基因主要富集在27個生物學(xué)途徑中,其中排第一的是Cytokine-cytokine receptor interaction這一生物途徑，遘含有差異表達(dá)基因71個。排在第二、第三的生物學(xué)途徑分別為Chemokine signaling pathway和Leukocyte transendothelial migration,分別含差異基因數(shù)為48和31。我們對差異表達(dá)的基因計(jì)算各自之間的Pearson相關(guān)系數(shù),構(gòu)建IncRNA-mRNA即編碼-非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(coding-noncoding geneco-expression network)。 研究結(jié)論： 1.GO分析：差異mRNAs分布在11個生物學(xué)進(jìn)程、12個細(xì)胞組件和11個分子功能中.KEGG分析：差異mRNAs分布在27個生物學(xué)途徑中； 2.通過構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖,初步分析IncRNA參與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展的基因網(wǎng)絡(luò)圖,生物信息學(xué)初步分析顯示這些IncRNA在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用,IncRNA可能是全新的舌鱗癌標(biāo)記物和潛在的基因治療靶點(diǎn) 全文結(jié)論： 1. IncRNA microarray基因芯片是篩選舌鱗癌差異表達(dá)基因的一種理想有效的方法； 2.首次利用IncRNA microarray基因芯片篩選出舌鱗癌組織和正常舌組織中存在的差異表達(dá)的IncRNAs,并利用實(shí)時熒光定量PCR對其中異常表達(dá)的部分IncRNAs予以驗(yàn)證,提高了芯片檢測結(jié)果的可信性,最后,利用生物信息學(xué)技術(shù)分析,表明差異表達(dá)的IncRNAs在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用； 3.G0分析：差異mRNAs分布在11個生物學(xué)進(jìn)程、12個細(xì)胞組件和11個分子功能中,KEGG分析：差異mRNAs分布在27個生物學(xué)途徑中,通過構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖,初步分析IncRNA參與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展的基因網(wǎng)絡(luò)圖,生物信息學(xué)初步分析顯示這些IncRNA在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用,IncRNA可能是全新的舌鱗癌標(biāo)記物和潛在的基因治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.86

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1837357