本文選題：低強(qiáng)度超聲 + IL-1β��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)的目的是探究低強(qiáng)度超聲作用于體外白介素1β因子刺激下大鼠顳下頜軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化,以及LIPUS對(duì)顳下頜軟骨細(xì)胞的骨保護(hù)作用。方法:取4周齡Wistar大鼠髁突軟骨細(xì)胞,于體外培養(yǎng)。在無(wú)菌的條件下,取雙側(cè)髁突組織,用含有雙抗的PBS,沖洗、剝離髁突軟骨,反復(fù)剪切至1mm3大小,首先在37℃環(huán)境下用0.25%濃度的胰蛋白酶消化30分鐘,然后37℃振蕩加入濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶,1-2小時(shí)消化完后、分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng),原代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)變化,通過(guò)每天用倒置光學(xué)顯微鏡觀測(cè),并用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色方法,來(lái)鑒定培養(yǎng)結(jié)果。隨機(jī)將髁突軟骨細(xì)胞第二代分為四組,分別用0、1、5、1Ong/mlIL-1β處理48小時(shí),對(duì)各組之間 Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG蛋白和mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并篩選出能造成髁突軟骨細(xì)胞炎性狀態(tài)的IL-1β最佳濃度和檢測(cè)IL-1β改變對(duì)于Wnt/β-catenin通路的不同影響;取已鑒定的髁突軟骨細(xì)胞P2隨機(jī)分為五組:對(duì)照組,細(xì)胞不做任何處理;IL-1β組,10ng/mlIL-1β 處理 48 小時(shí);LIPUS 組,10ng/mlIL-1β 處理 48 小時(shí)后 LIPUS每天處理20分鐘,共七天�？瞻踪|(zhì)粒+LIPUS組:10ng/mlIL-1β處理48小時(shí),提前48小時(shí)加入空載質(zhì)粒后LIPUS每天處理20分鐘,共七天。siRNA+LIPUS組:10ng/mlIL-1β處理48小時(shí),提前48小時(shí)加入DKK1干擾質(zhì)粒siRNA后LIPUS每天處理20分鐘,共七天。分別用western blotting檢測(cè)各組之間Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG 的蛋白表達(dá)量;qRT-PCR檢測(cè)各組 Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG mRNA表達(dá)量;倒置熒光顯微鏡觀測(cè)siRNA對(duì)于軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果:(1)消化髁突,提取軟骨細(xì)胞接種,觀察見(jiàn)細(xì)胞呈形態(tài)規(guī)則、小圓形。一天后,細(xì)胞多數(shù)貼壁,鏡下觀察可呈多邊形或者星形;5天后,可觀察到"鋪路石"樣。經(jīng)一次傳代后,細(xì)胞貼壁的速度明顯變快,勻稱(chēng)分布;據(jù)我們觀察在4代以?xún)?nèi),軟骨細(xì)胞增殖速率較快。在此以后,髁突軟骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,出現(xiàn)"去極化"現(xiàn)象,生長(zhǎng)速度加快。胞漿內(nèi)可見(jiàn)有棕黃色顆粒和紅色熒光顆粒,通過(guò)Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)。(2)1Ong/mlIL-1β降低髁突軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和AGG表達(dá)的效果最明顯,對(duì)于Wnt/β-catenin通路有顯著促進(jìn)作用,同時(shí)DKK1表達(dá)升高。(3)低強(qiáng)度超聲干預(yù)炎性髁突軟骨細(xì)胞后,collagenⅡ、AGG表達(dá)水平明顯升高,Wnt3a、β-catenin、GSK3β下降,DKK1表達(dá)升高;低強(qiáng)度超聲干預(yù)并加入DKK1干擾RNA后,DKK1,collagenⅡ、AGG表達(dá)水平下降,Wnt3a、β-catenin、GSK3β表達(dá)升高。結(jié)論:低強(qiáng)度超聲通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路并且刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,一定程度上阻斷并抑制了骨關(guān)節(jié)炎退行性變化,對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有潛在的治療保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)了低強(qiáng)度超聲對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的潛在骨保護(hù)作用的認(rèn)識(shí)理解,并且需要更多的臨床研究用于證實(shí)這一效果,為臨床治療TMJ-OA提供新方式。
[Abstract]:Objective : To investigate the changes of Wnt / 尾 - catenin signaling pathway in rat temporo - mandibular cartilage cells induced by low - intensity ultrasound and to investigate the effect of LIPUS on the bone protection of temporo - mandibular cartilage cells . The expressions of Wnt3a , 尾 - catenin , GSK3 尾 , p - GSK3 尾 , DKK1 , 鈪，

本文編號(hào)：1815447