本文選題：牙周炎 + 糖尿病　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 牙周炎是由牙菌斑微生物引起的慢性感染性疾病,宿主對微生物產(chǎn)生的不恰當?shù)拿庖叻磻?yīng)是造成牙周組織破壞的主要原因。大量流行病學研究結(jié)果顯示,糖尿病是牙周炎發(fā)生的重要風險因素,糖尿病患者發(fā)生牙周炎的風險比正常人群高3-5倍,而血糖控制情況是增加牙周炎風險的關(guān)鍵因素。因而,牙周炎已被認為是糖尿病的第六大并發(fā)癥。然而,有關(guān)糖尿病增加牙周炎易感性、促進牙周炎發(fā)病的病理機制,仍不明確。 糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)是常見的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病,同時也是一種慢性炎癥性疾病,其在本質(zhì)上可表現(xiàn)為機體的低度炎癥狀態(tài)(Low-grade Inflammation)。而這種低度炎癥狀態(tài)來源于內(nèi)源性配體刺激先天免疫細胞產(chǎn)生和分泌前炎癥因子,如自由脂肪酸或糖基化終端產(chǎn)物等通過結(jié)合Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)激活NF-κB途徑,從而誘導白細胞粘附分子的上升和造血細胞和內(nèi)皮細胞的前炎癥因子和造血因子的產(chǎn)生。糖尿病作為一種低度炎癥狀態(tài)表現(xiàn)為多種炎癥因子上升,如IL-6、IL-1β等。近年大量研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者TLR2、TLR4在多種組織、細胞中的表達都發(fā)生了改變,如外周血單核細胞、脂肪組織、骨組織、腎小管和腎間質(zhì),TLR-2、4敲除可減弱了鼠糖尿病和早期糖尿病腎病的低度炎癥狀態(tài)�？梢�,糖尿病可通過TLRs途徑促進包括腎病、血管性疾病等多個相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生,但糖尿病是否通過TLRs途徑促進牙周炎的進展仍不明確。 TLRs是天然免疫系統(tǒng)中特異的Ⅰ-型跨膜受體及病原模式識別受體,在急性炎癥反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡中起重要作用。在炎癥疾病的相關(guān)報道中,以TLR-2,4的相關(guān)研究居多。TLR-2,4不但可以與外源性配體結(jié)合,還可以和內(nèi)源性配體產(chǎn)生反應(yīng),包括熱休克蛋白、細胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物等。研究發(fā)現(xiàn),TLR-2,4在多種炎癥疾病中起重要作用,包括：糖尿病、腎病、炎癥性腸炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、心血管、肝炎等。近年來,TLR-2,4在牙周炎發(fā)病中的重要作用已逐漸為研究人員所認識。TLRs途徑在維持牙周健康和促進牙周炎發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用,特別當細菌侵入深層牙齦組織后,TLRs能誘導牙周炎癥的發(fā)生和加重牙周組織的破壞。因此,TLRs作為一把雙刃劍,不僅有助于保持牙周健康,也有助于導致牙周組織破壞。TLR在固有免疫系統(tǒng)中作用機制的揭示將為牙周炎這一感染性疾病的發(fā)生發(fā)展提供新視野。 近來研究表明TLR-2、4在糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病血管性并發(fā)癥等低度炎癥狀態(tài)中具有關(guān)鍵作用。鑒于TLR-2、4在牙周炎發(fā)病中的重要作用,推測糖尿病可能經(jīng)TLR途徑誘導牙周組織發(fā)生低度炎癥狀態(tài),從而增加了糖尿病患者牙周炎易感性,促進牙周炎的發(fā)生發(fā)展。因此,本研究擬從體內(nèi)外研究糖尿病狀態(tài)下牙周組織中TLR2、TLR4及炎癥因子表達的調(diào)控變化,進而探討TLR2、 TLR4在糖尿病狀態(tài)下牙周組織低度炎癥狀態(tài)發(fā)生中的作用,為探討TLR2.TLR4作為防治牙周炎靶點的可行性提供初步研究依據(jù)。 第一章糖尿病狀態(tài)下TLR-2、4在大鼠牙周組織中的表達研究第一節(jié)糖尿病大鼠模型的建立 1.研究目的 通過建立2種不同的Ⅱ型糖尿病大鼠模型,即自發(fā)性Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠模型和鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導性的Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型,為進一步研究糖尿病狀態(tài)下牙周組織TLR-2、4及炎癥因子的表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。 2.研究方法 模型一： (1)自發(fā)性Ⅱ型糖尿病Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)大鼠：(O組),4周齡,雄性,10只；同種系同周齡糖耐量正常的Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO)大鼠(L組),雄性,8只。每4周行一次口服糖耐量OGTT (oral glucose tolerance test)檢測,按2g/kg予50%葡萄糖溶液灌胃,依據(jù)OGTT試驗的結(jié)果判定,同時符合血糖峰值16.7mmol/L和葡萄糖灌胃后120min血糖11.1mmol/L時診斷為糖尿病。 (2)分別在36周、46周及56周時,監(jiān)測大鼠體重,并觀察其體重和血糖的變化。采用尾靜脈采血測定其血清胰島素水平的動態(tài)變化并計算糖尿病胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型(Homeostasis model assessment-insulin resistance HOMA-IR)值。 (3)56周齡時,處死所有實驗大鼠,評估牙齦大體形態(tài)、質(zhì)地,收集頜骨樣本,EDTA脫鈣后HE染色,觀察牙周組織病理改變。 模型二： (1)20只9周齡的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠隨機分為2組(n=10)：糖尿病組(DM),和正常對照組(H)； (2)DM組：高脂飲食4周后,通過腹腔內(nèi)注射STZ(35mg/kg);H組：正常飲食4周后,注射檸檬酸緩沖液(0.25ml/kg)。3天后測血糖,血糖高于16.7mmol/L (300mg/dl)診斷為DM,注射STZ后6周時進行胰島素挑戰(zhàn)實驗,判定糖尿病模型成功的建立； (3)25周齡時,處死所有實驗大鼠,評估牙齦大體形態(tài)、質(zhì)地,收集頜骨樣本,EDTA脫鈣后HE染色,觀察牙周組織病理改變。 3.研究結(jié)果 一般體征：OLETF大鼠及STZ誘導的糖尿病SD大鼠均出現(xiàn)多食、多飲、多尿、倦怠少動、毛無光澤且凌亂等體征,而LETO大鼠和正常SD大鼠則飲食飲水量正常,精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,毛順光亮。 體重變化：兩種不同動物模型的體重變化趨勢不同。糖尿病自發(fā)大鼠模型中,OLETF大鼠隨著實驗時間進展,其體重逐漸高于同周齡的對照LETO大鼠(F=3.922,P=0.033)(圖1-1,表1-1)；而藥物STZ誘導性糖尿病SD大鼠模型中,糖尿病SD大鼠在高脂飲食階段的體重略高于對照組,但在注射STD后的體重逐漸低于同周齡的正常組大鼠(F=70.994,P=0.000)。 建模指標檢測：自發(fā)性T2DM大鼠模型中,采用OGTT值計算AUC的結(jié)果顯示OLETF大鼠的血糖情況,在36周齡時到達IGT期開始進入糖尿病發(fā)病的前期,46周齡左右為糖尿病發(fā)病的穩(wěn)定期,模擬了人類T2DM的慢性發(fā)病的過程；STZ誘導的糖尿病SD大鼠在注射STZ后3天的隨機血糖顯著高于正常對照大鼠(t=-39.048,P=0.000),在注射STZ后6周的胰島素挑戰(zhàn)實驗顯示DM組存在胰島素抵抗,高脂飲食加STZ誘導的糖尿病SD大鼠成功建立。 牙周組織的大體外觀情況：對比兩組模型的糖尿病組和正常組大鼠的牙齦形狀、顏色和質(zhì)地沒有明顯差異,牙齦均未發(fā)現(xiàn)明顯退縮。 牙周組織HE染色結(jié)果表明：兩組模型的正常組和糖尿病組大鼠的牙周組織均表現(xiàn)為齦溝底位于釉牙骨質(zhì)界處,結(jié)合上皮附著緊密,膠原纖維排列有序,牙槽骨無明顯吸收,未見明顯炎癥細胞聚集,牙周組織附著未見喪失。本研究結(jié)果提示：糖尿病組與正常組大鼠的牙周組織病理學形態(tài)無顯著性差異。 4.結(jié)論 本課題組成功建立了OLETF大鼠自發(fā)性2型糖尿病模型和STZ誘導性2型糖尿病大鼠模型,糖尿病狀態(tài)下大鼠的牙周組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著性差異。 第二節(jié)糖尿病狀態(tài)下牙周組織中TLR-2、4及炎癥因子的表達研究 1.研究目的 通過檢測TLR-2、4及炎癥因子在糖尿病大鼠牙周組織中的表達調(diào)控,分析糖尿病狀態(tài)下牙周組織局部免疫防御機制的可能變化。 2.研究方法 采用免疫組化Envision二步法對大鼠牙齦組織切片進行TLR2、TLR4檢測,采用圖形分析軟件對組織切片染色進行半定量分析。 Trizol提取樣本總RNA,通過實時熒光定量RT-PCR的方法,以β-actin為內(nèi)參基因,檢測TLR2、TLR4、IL-6、IL-1β和NF-κB p65在大鼠牙齦樣品中的轉(zhuǎn)錄水平。 3.研究結(jié)果 免疫組織化學檢測大鼠牙齦組織中TLR2的表達顯示：TLR2主要在牙齦上皮細胞中有表達,并定位于細胞膜和細胞質(zhì)中。在少量成纖維細胞,炎癥細胞和血管內(nèi)皮細胞也顯示有TLR2的陽性表達。在牙齦上皮細胞中,TLR2在上皮基底層和棘層細胞染色最強,向表層細胞表達逐漸減弱。兩種模型中糖尿病大鼠牙齦組織TLR2表達水平均顯著高于相應(yīng)的正常大鼠(OLETF:t=-4.085, P=0.001;t--5.078, P=0.000)。 IHC檢測大鼠牙齦組織中TLR4的表達顯示：TLR4與TLR2的表達特征類似,主要表達在牙齦上皮細胞,并定位于細胞膜和細胞質(zhì)中。在少量成纖維細胞,炎癥細胞和血管內(nèi)皮細胞也顯示有TLR4的陽性表達。但在牙齦上皮中,TLR4的表達強度分布與TLR2正好相反,TLR4在上皮表層細胞/棘層細胞染色最強,向基底層細胞表達逐漸減弱。兩種模型中糖尿病大鼠牙齦組織TLR4表達水平均顯著高于相應(yīng)的正常大鼠(OLETF:t=-2.623, P=0.020; STZ:t=-3.995, P=0.001)。 RT-PCR檢測結(jié)果顯示：兩種不同糖尿病模型中大鼠牙齦組織中TLR2和TLR4的mRNA,發(fā)現(xiàn)兩者的表達水平均高于相應(yīng)的正常大鼠,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。mRNA相對表達量與免疫組織化學表達結(jié)果趨勢一致,提示糖尿病促進了大鼠牙齦組織中TLR2和TLR4的表達。 相關(guān)炎癥因子在STZ誘導性的糖尿病SD大鼠模型牙齦組織中的mRNA水平,研究結(jié)果顯示：糖尿病組大鼠牙齦組織中的前炎癥因子IL-1β、IL-6和NF-κB的mRNA水平均高于正常大鼠組,其中IL-1β、IL-6的表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.結(jié)論 在糖尿病狀態(tài)下,TLR2、TLR4及炎癥因子在大鼠牙齦組織中的表達升高,提示糖尿病機體內(nèi)牙周局部組織的免疫防御機能可能發(fā)生改變,使得糖尿病機體在一定程度上更易于罹患牙周炎。 第二章TLR-2、4在高糖狀態(tài)下人牙齦上皮細胞中的體外表達研究第一節(jié)高糖狀態(tài)下人牙齦上皮細胞的生物學特性 1.研究目的 通過構(gòu)建人牙齦上皮細胞(human gingival epithelial cells, HGECs)體外高糖培養(yǎng)體系,以模擬糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境,探討高糖對人牙齦上皮細胞生物學特性的影響。 2.研究方法 在臨床上收取18-30歲健康青年牙齦組織,采用酶消化法,體外培養(yǎng)HGECs原代細胞。選取處于對數(shù)生長期的第3代細胞用于后續(xù)實驗。制備細胞爬片,采用細胞免疫組織化學染色檢測細胞純度。 具體實驗分組如下：(1)高糖組：使用含25mmol/L D-葡萄糖的K-SFM培養(yǎng)基；(2)正常組：使用含5.5mmol/L D-葡萄糖的K-SFM培養(yǎng)基；(3)等滲組：使用含5.5mmol/L D-葡萄糖及19.5mmol/L甘露醇的K-SFM培養(yǎng)基。 采用MTS法,檢測高糖下人牙齦上皮細胞的增殖情況；采用流式細胞術(shù),檢測高糖下人牙齦上皮細胞的生長周期情況及凋亡情況；采用細胞劃痕實驗,檢測高糖對人牙齦上皮細胞遷移能力的影響。 3.研究結(jié)果 免疫細胞化學染色結(jié)果顯示：牙齦上皮細胞抗角蛋白染色為陽性表達,抗波形蛋白染色為陰性表達,表明細胞是上皮性來源。 鏡下觀察顯示：高糖組、等滲組和正常組在原代至第3代細胞的細胞生長狀況和形態(tài)均相似,無明顯差異。 MTS檢測結(jié)果顯示：高糖對于人牙齦上皮細胞的增殖活性無顯著影響,滲透壓也沒有改變細胞的增殖活性(P0.05)。 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：正常組、高糖組及等滲組人牙齦上皮細胞三組細胞的分裂增殖能力無顯著差異(P0.05)；正常組、高糖組及等滲組人牙齦上皮細胞凋亡細胞比例的差異無統(tǒng)計學意義P0.05)。 劃痕愈合實驗結(jié)果顯示：劃痕24h時,細胞遷移的距離與劃痕寬度的比例在正常糖組顯著高于高糖組(P0.05)。 4.結(jié)論 高糖培養(yǎng)下,牙齦上皮細胞形態(tài)、增殖及凋亡均未發(fā)生顯著改變,但高糖在一定程度上削弱了細胞遷移能力,提示糖尿病機體的牙周組織愈合能力可能弱于正常機體。 第二節(jié)高糖狀態(tài)對人牙齦上皮細胞中TLR-2、4及炎癥因子的表達影響 1.研究目的 通過體外高糖狀態(tài)下檢測人牙齦上皮細胞TLR2、TLR4及相關(guān)炎癥因子的表達,為進一步的體外功能研究奠定實驗基礎(chǔ)。 2.研究方法 按前述方法構(gòu)建人牙齦上皮細胞體外培養(yǎng)體系,實驗分組同前,分為正常組、高糖組和等滲組。 收集各組細胞樣本,Trizol法抽提細胞總RNA,實時熒光定量RT-PCR檢測TLR2、TLR4、IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄水平,以β-actin為內(nèi)參基因； 采用流式細胞術(shù)檢測各組TLR2、TLR4陽性細胞比例；收集細胞培養(yǎng)上清,采用ELISA方法定量檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8的蛋白水平。 3.研究結(jié)果 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：牙齦上皮細胞TLR4分別在12h、24h時點各組間無顯著性差異,但在48h時,高糖組TLR4mRNA水平(14.03±3.34)約為正常組(7.47±2.02)的2倍,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022),等滲組與正常組間則無顯著差異(P0.05)；而TLR2在三組牙齦上皮細胞中的mRNA表達無顯著差異(P0.05)。 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與實時熒光定量PCR結(jié)果類似,高糖組牙齦上皮細胞中TLR4陽性細胞比例高于正常組和等滲組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而牙齦上皮細胞中的TLR2陽性細胞比例在三組間無顯著性差異(P0.05)。 對于炎癥因子的檢測,實時熒光定量RT-PCR結(jié)果表明：牙齦上皮細胞IL-6分別在12h、24h時各組間無顯著性差異,但是在48h時,IL-6的mRNA水平在高糖組(5.82±1.84)約為正常組(2.88±0.77)表達的2倍,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)；而等滲組與正常組間無顯著差異(P0.05)；然而,牙齦上皮細胞IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的mRNA表達水平在各組、各時點均未出現(xiàn)顯著性改變(P0.05)。 ELISA檢測結(jié)果顯示：牙齦上皮細胞上清液中的IL-8在各組、各時點均未出現(xiàn)顯著性改變(P0.05)；由于各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6濃度峰值較低,ELISA方法檢測到各組細胞上清中IL-6的表達水平處于試劑盒檢測范圍下限,故未作統(tǒng)計比較。 4.結(jié)論 高糖狀態(tài)下TLR4、IL-6在人牙齦上皮細胞中表達上調(diào),而TLR2、IL-1β IL-8、TNF-α、MCP-1、NF-κB p65的表達無顯著影響,提示高糖在一定程度上影響了牙齦上皮細胞的炎性分泌機制。 第三章TLR4在高糖狀態(tài)下牙齦上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用研究 1.研究目的 通過體外阻斷TLR4在牙齦上皮細胞中的表達,檢測TLR4在高糖以及LPS刺激時對細胞炎性反應(yīng)中的表達變化,以期探討TLR4在糖尿病機體內(nèi)牙周局部組織防御中的可能作用。 2.研究方法 按前述方法,建立人牙齦上皮細胞體外培養(yǎng)體系。正常組和高糖組人牙齦上皮細胞分別培養(yǎng)48h后,分別以濃度為0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的LPS加入至兩組培養(yǎng)基中,在2h、4h和8h時,熒光定量RT-PCR檢測前炎癥因子(IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1)的轉(zhuǎn)錄水平,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-8的表達水平。 正常組和高糖組人牙齦上皮細胞分別培養(yǎng)48h后,分別分為4個處理組：空白、LPS(1μg/ml)、TAK-242(1μM)、LPS+TAK-242。其中TAK-242處理組和LPS+TAK-242處理組預加入TAK-242處理1h后,再予LPS和LPS+TAK-242處理組分別加1μg/ml的LPS刺激,8h后熒光定量RT-PCR檢測相應(yīng)炎癥因子(IL-6、IL-8、MCP-1)的mRNA水平,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-8的表達水平及Westerblot檢測NF-κB的蛋白水平。 3.研究結(jié)果 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：LPS刺激上調(diào)了人牙齦上皮細胞IL-1β、 IL-6、IL-8、MCP-1的mRNA水平,高糖可進一步促進LPS誘導的IL-1β、IL-6、 IL-8、MCP-1mRNA水平高表達；TLR4拮抗劑TAK-242有效阻斷了高糖和LPS誘導人牙齦上皮細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、NF-κB的表達上升。 ELISA檢測結(jié)果顯示：LPS可促進人牙齦上皮細胞上清液中IL-8的表達,高糖可進一步增加LPS誘導的細胞上清液中IL-8高表達；TAK-242可有效阻斷高糖和LPS誘導人牙齦上皮細胞上清液中IL-8的分泌表達。 4.結(jié)論 高糖以及LPS誘導下牙齦上皮細胞的炎性分泌顯著增加,而TLR4在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,提示TLR4相關(guān)信號通路在糖尿病性牙周炎的發(fā)生發(fā)展可能發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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本文編號：1773839