本文選題：血清淀粉蛋白A2 + Toll樣受體-2��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:本研究旨在比較健康和慢性牙周炎兩種不同來源的牙齦組織中血清淀粉樣蛋白A2(serum amyloid A2,SAA2)的表達(dá)差異性;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)在受到Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)2配體Pam3CSK4或TLR4配體大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,SAA2及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的改變;TLR2或TLR4抗體中和實(shí)驗(yàn)檢測SAA2的表達(dá);以及siRNA抑制SAA2后,炎性細(xì)胞因子的表達(dá),從而研究SAA2在慢性牙周炎的作用,初步探索SAA2與TLRs信號通路的關(guān)系,為進(jìn)一步闡明牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.經(jīng)患者知情同意,收集就診于天津醫(yī)科大學(xué)口腔頜面外科及牙周科患者,根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選研究對象,獲取牙齦組織后立即放入裝有RNA保護(hù)液的離心管中或者裝有福爾馬林溶液的離心管中浸泡,備用。2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測健康及慢性牙周炎牙齦組織中SAA2 m RNA的表達(dá);免疫組織化學(xué)方法檢測健康及慢性牙周炎牙齦組織SAA2蛋白的表達(dá)及分布。3.將收集的健康牙齦組織,立即置入含有10%雙抗的磷酸鹽緩沖液中保存,采用組織塊法體外培養(yǎng)HGFs。4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同濃度的Pam3CSK4(0、0.1、1、5、10μg/ml)或者E.coli LPS(0、0.1、1、5、10μg/ml)刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,SAA2及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的m RNA表達(dá)。5.抗體中和實(shí)驗(yàn):TLR2抗體作用于HGFs,1μg/ml Pam3CSK4刺激后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測SAA2及細(xì)胞因子IL-1βm RNA表達(dá)。TLR4抗體作用于HGFs,1μg/ml E.coli LPS刺激后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測SAA2及細(xì)胞因子IL-1βm RNA表達(dá)。6.siRNA-SAA2轉(zhuǎn)染健康HGFs,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,提取細(xì)胞總RNA及總蛋白進(jìn)行RT-PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢測SAA2的表達(dá)情況。7.siRNA-SAA2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測1μg/ml Pam3CSK4或者E.coli LPS刺激HGFs后炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、以及TLR4、TLR2、簇分化抗原14(cluster of differentiation 14,CD14)的表達(dá)。結(jié)果:1.健康及慢性牙周炎牙齦組織中均有SAA2 mRNA的表達(dá),但是慢性牙周炎牙齦組織SAA2的表達(dá)較健康牙齦組織明顯增高(p0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:慢性牙周炎牙齦上皮及纖維結(jié)締組織細(xì)胞中有SAA2的表達(dá),而健康牙齦SAA2表達(dá)不明顯。2.組織塊貼壁法體外培養(yǎng)HGFs,細(xì)胞形態(tài)為長梭形并呈放射狀排列,生長活性較好。Real-time PCR結(jié)果顯示:與對照組相比,E.coli LPS或Pam3CSK4刺激HGFs后SAA2、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αm RNA水平均有不同程度的升高。3.TLR2抗體阻斷Pam3CSK4(1μg/ml)刺激HGFs后,IL-1β表達(dá)水平下降(p0.05),SAA2表達(dá)無差異性(p0.05)。TLR4抗體阻斷E.coli LPS(1μg/ml)刺激HGFs后,SAA2、IL-1β表達(dá)水平均下降(p0.05)。4.顯微鏡下觀察Cy3熒光,細(xì)胞計(jì)數(shù)得出siRNA的轉(zhuǎn)染效率約為75%。實(shí)時(shí)定量PCR檢測siRNA對SAA2 m RNA的抑制作用約達(dá)99%;蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-SAA2可明顯減少SAA2蛋白的表達(dá)。5.siRNA-SAA2轉(zhuǎn)染后,1μg/ml Pam3CSK4刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,SAA2、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05),IL-8在6 h及12 h時(shí)明顯下調(diào),在24 h時(shí)明顯上調(diào)(p0.05)。TNF-αm RNA表達(dá)水平則在6 h、12 h、24 h時(shí)都增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。TLR2在6 h表達(dá)下降,12 h表達(dá)上調(diào)(p0.05),24 h則無變化;TLR4的表達(dá)6 h沒有變化,而在12 h及24 h表達(dá)上調(diào)。CD14在6 h表達(dá)下降(p0.05),12 h及24 h表達(dá)增加(p0.05)。6.siRNA-SAA2轉(zhuǎn)染后,1μg/ml E.coli LPS刺激HGFs 6 h、12 h、24 h后,可見,SAA2、IL-1β、IL-6、IL-8明顯的下調(diào)(p0.05),而TNF-α在6 h和24 h時(shí)m RNA表達(dá)水平增加(p0.05),12 h時(shí)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。TLR2在6 h及12 h表達(dá)降低(p0.05),24 h(p0.05)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLR4在6 h表達(dá)量下降(p0.05),12 h及24 h表達(dá)上調(diào)(p0.05)。CD14在6 h時(shí)表達(dá)無差異(p0.05),12 h及24 h表達(dá)上調(diào)(p0.05)。結(jié)論:1.SAA2可能參與慢性牙周炎的炎癥過程。2.HGFs中SAA2的誘導(dǎo)TLR4途徑關(guān)系密切。3.SAA2可能通過TLRs途徑影響HGFs中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of SAA2 and SAA2 in gingival tissues of healthy and chronic periodontitis , and to investigate the expression of SAA2 and inflammatory cytokines in gingival tissues of healthy and chronic periodontitis . The expression of SAA2 , IL - 6 , IL - 8 , TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 8 , TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 8 and TNF - 偽 mRNA in gingival tissues of chronic periodontitis were detected by RT - PCR and Western blot . The expression of IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 8 , IL - 1尾 , IL - 6 and IL - 8 were significantly downregulated at 6 h , 12 h and 24 h ( p < 0.05 ) . Conclusion : 1.SAA2 may be involved in the inflammatory process of chronic periodontitis . Conclusion : 1.SAA2 may be involved in the inflammatory process of chronic periodontitis . Conclusion : 1.SAA2 may be involved in the inflammatory process of chronic periodontitis .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1764478