本文選題：肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖 + 樣糖基轉(zhuǎn)移酶�。� 參考：《武漢大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：口腔癌是世界第六大惡性腫瘤,其中在中國每年約有21000例新發(fā)病例,大約11000人死亡。舌癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因。如何控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和提高癌癥患者的生存率則成為口腔鱗癌研究的重點(diǎn)。 細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的丟失是惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的重要特征。DG是一種普遍存在于組織的粘附分子,通常表達(dá)于細(xì)胞膜與基底膜之間的界面,充當(dāng)了細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用的“分子橋”。DG對調(diào)節(jié)基底膜形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞極化、細(xì)胞生長、信號傳導(dǎo)及維持組織整合性等起著重要作用,DG在腫瘤生物學(xué)中的作用越來越受到關(guān)注。在許多上皮細(xì)胞癌中都觀察到α-DG蛋白的表達(dá)缺失,提示其在癌癥發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,但是其缺失的機(jī)制仍然不清楚。在已知的七種參與α-DG翻譯后糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶中,LARGE是a-DG糖基化過程和決定α-DG生物學(xué)功能的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶基因。那么,舌癌中是樣糖基轉(zhuǎn)移酶LARGE基因是否出現(xiàn)了功能失活,以致于α-DG的正常糖基化過程無法啟動?具體失活機(jī)制又是什么?目前尚不清楚。本研究將對這些問題進(jìn)行初步探討。 實驗一α-DG在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)異常與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系 目的：探討α-DG在舌癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,分析a-DG表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系,研究導(dǎo)致其缺失的原因是發(fā)生于轉(zhuǎn)錄翻譯的過程中、還是發(fā)生在翻譯后修飾階段。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測50例舌鱗狀細(xì)胞癌組織和13例正常粘膜組織中,western blot檢測舌癌細(xì)胞系(CAL27, SCC4)中α-DG的表達(dá),RT-PCR驗證舌癌細(xì)胞系中DAG1基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果：與正常組織相比,α-DG(VIA4-1)和α-DG(IIH6)在舌癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯降低,而α-DG(6C1或F-18)表達(dá)無明顯差異。α-DG(VIA4-1)和α-DG(IIH6)的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期(N=50,P=0.005,0.013)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.016,0.025)明顯相關(guān),α-DG(IIH6)的表達(dá)水平還與腫瘤大小相關(guān)(P=0.016,0.025)。RT-PCR結(jié)果DGmRNA無明顯改變。結(jié)論：舌癌中α-DG糖基化位點(diǎn)表達(dá)明顯降低,且與臨床病理關(guān)系密切。α-DG的缺失并不是由于基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程異常,而是與翻譯后糖基化修飾有關(guān)。 實驗二LARGE在舌鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)研究 目的：探討LARGE是否在舌癌中正常表達(dá),檢測舌癌組織級細(xì)胞中的LARGE基因是否發(fā)生了過度甲基化,分析舌癌中的α-DG糖基化異常是否與LARGE基因異常有關(guān)。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測50例舌鱗狀細(xì)胞癌組織和13例正常粘膜組織中LARGE的表達(dá),甲基化特異性PCR檢測舌癌組織級細(xì)胞系中LARGE基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),分析LARGE表達(dá)及甲基化狀態(tài)與臨床病理因素的關(guān)系。RT-PCR驗證舌癌細(xì)胞系中LARGE基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果：與正常粘膜相比,LARGE在舌癌中表達(dá)明顯降低(P=0.01),基因啟動子區(qū)甲基化幾率明顯增高(P=0.01)。細(xì)胞系中未檢測到表達(dá),且RT-PCR未檢測至LARGE mRNA的轉(zhuǎn)錄。LARGE表達(dá)降低和啟動子區(qū)過甲基化與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.022,0.015)、TNM分期相關(guān)(P=0.000,0.043)。LARGE過甲基化與α-DG糖基化表位的表達(dá)呈明顯相關(guān)。結(jié)論：在舌癌中,LARGE低表達(dá),其基因失活,主要原因可能是由于其啟動子區(qū)過度甲基化,因而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄缺失,進(jìn)而引起α-DG糖基化降低甚至缺失。 實驗三LARGE過表達(dá)及去甲基化對α-DG功能性表達(dá)的影響 目的：研究體外轉(zhuǎn)染過表達(dá)LARGE或去甲基化試劑物5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, Aza-dC)處理是否能恢復(fù)LARGE的表達(dá),是否能修復(fù)α-DG的糖基化。方法：構(gòu)建重組LARGE表達(dá)載體,舌癌細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染或Aza-dC處理后,RT-PCR檢測LARGE和DGmRNA, western blot檢測α-DG蛋白主鏈及糖基化表位表達(dá)情況。結(jié)果：舌癌細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染LARGE或Aza-dC處理后,LARGE和DG mRNA表達(dá)增加,α-DG主鏈無明顯差別,a-DG (VIA4-1)和α-DG (IIH6)即糖基化表位則明顯較對照組表達(dá)明顯升高。結(jié)論：外源性LARGE表達(dá)載體轉(zhuǎn)染和去甲基化均能使舌癌細(xì)胞中LARGE恢復(fù)表達(dá),從而修復(fù)a-DG的糖基化。 實驗四LARGE過表達(dá)及啟動子區(qū)去甲基化對舌鱗癌細(xì)胞功能的影響 目的：研究轉(zhuǎn)染外源性LARGE表達(dá)載體轉(zhuǎn)染和去甲基化處理恢復(fù)的α-DG糖基化是否修復(fù)了細(xì)胞功能、α-DG與細(xì)胞外基質(zhì)配體結(jié)合能力是否增強(qiáng)、腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力是否改變。方法：舌癌細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染或Aza-dC處理后,層粘連蛋白覆蓋分析α-DG與細(xì)胞外基質(zhì)成分laminin結(jié)合能力,細(xì)胞粘附分析腫瘤細(xì)胞與laminin粘附能力,Transwell遷移實驗分析細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果：5-dA處理和外源性LARGE過表達(dá)后,α-DG與其層粘連蛋白laminin結(jié)合能力均較對照組明顯增加,癌細(xì)胞與層粘連蛋白laminin的結(jié)合能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞遷移能力明顯下降。結(jié)論：5-dA處理和外源性LARGE過表達(dá)能恢復(fù)LARGE的表達(dá),修復(fù)了DG功能性糖基化,從而使腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)中層粘連蛋白laminin結(jié)合能力增強(qiáng),腫瘤細(xì)胞由基底膜逃離幾率減小,使腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷徙能力減弱。 以上研究結(jié)果表明,在舌鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中,α-DG糖基化表位降低甚至缺失,LARGE表達(dá)明顯降低且其啟動子區(qū)過甲基化,α-DG和LARGE的異常與舌癌臨床分期和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理學(xué)參數(shù)關(guān)系密切。過表達(dá)LARGE或去甲基化可修復(fù)舌癌細(xì)胞中α-DG糖基化,增強(qiáng)α-DG與細(xì)胞外基質(zhì)Laminin親和力,降低細(xì)胞遷移能力。研究結(jié)果提示舌癌中α-DG糖基化異常是由于糖基轉(zhuǎn)移酶LARGE啟動子區(qū)過度甲基化所導(dǎo)致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.86

【共引文獻(xiàn)】

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