本文選題：牙齦卟啉單胞菌 + 具核梭桿菌��； 參考：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景和目的牙周炎是多種細(xì)菌混合感染所致的口腔炎癥性病變,可以導(dǎo)致牙周支持組織的破壞和牙齒的松動(dòng)脫落。以往的研究表明,牙周組織的細(xì)菌性感染是由口腔菌群和其周?chē)纳掀ぜ?xì)胞相互作用的結(jié)果。因此,研究不同種類(lèi)的牙周致病菌及其宿主細(xì)胞之間的互動(dòng)影響是非常必要的。到目前為止,在齦下菌斑生物膜中發(fā)現(xiàn)至少有300多種不同種類(lèi)的細(xì)菌。齦下細(xì)菌的聚集有一定規(guī)律,按照它們的聚集特點(diǎn)以及與牙周狀況的關(guān)系,分為6個(gè)主要的微生物復(fù)合體。與牙周炎關(guān)系緊密的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)和伴放線(xiàn)聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)分別為紅色復(fù)合體和綠色復(fù)合體。然而,他們經(jīng)常在橙色復(fù)合體存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn),比如有具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)的微生態(tài)系。Fn是一種有致病潛力的口腔共生菌,其獨(dú)特之處是能夠與幾乎所有的口腔細(xì)菌發(fā)生共聚,可以作為共聚橋連接早期定植的細(xì)菌和晚期定植的細(xì)菌。因其具有廣泛的共聚能力被認(rèn)為在牙菌斑成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用,在牙周病變的進(jìn)展過(guò)程中起到了間接的促進(jìn)作用。此外,有研究表明Fn能夠與Pg和Aa相互影響。與其他感染性疾病相似,致病菌對(duì)上皮細(xì)胞表面的粘附和隨即發(fā)生的入侵過(guò)程是牙周炎發(fā)病的關(guān)鍵階段。數(shù)十年以來(lái),致病菌的入侵能力一直被認(rèn)為是牙周炎的潛在致病因子。由于不同菌種之間的相互作用,Pg、Aa與Fn的相互共聚、同時(shí)感染可能會(huì)影響它們對(duì)牙齦上皮細(xì)胞的粘附和入侵。細(xì)菌與其周?chē)掀ぜ?xì)胞間的相互作用是細(xì)菌感染過(guò)程中的重要階段,牙齦上皮細(xì)胞既是物理性屏障,同時(shí)還傳遞細(xì)菌信號(hào),是檢測(cè)細(xì)菌存在的傳感器,維持健康和疾病之間的平衡。在先天性免疫防御機(jī)制中,細(xì)菌與上皮細(xì)胞之間的相互作用可以刺激上皮細(xì)胞表達(dá)多種免疫反應(yīng)介質(zhì)。其中,白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)是一種強(qiáng)有效的致炎因子,能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化、激活中性粒細(xì)胞并且誘導(dǎo)其增殖。而β-防御素族的人β-防御素2(human β-defensin 2,hBD-2)不僅可以吸引單核細(xì)胞、促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化,也能夠激活先天性和獲得性免疫防御。在先天性免疫應(yīng)答中,橙色復(fù)合體中的細(xì)菌和紅色復(fù)合體中的細(xì)菌所產(chǎn)生的功效是不同的,分別歸屬于兩種不同復(fù)合體的細(xì)菌間的相互影響可能會(huì)調(diào)節(jié)IL-8和hBD-2的表達(dá),從而在牙齦組織的免疫調(diào)節(jié)方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。因此,本研究的目的在于觀(guān)察Fn與主要的牙周致病菌Pg、Aa的相互共聚、同時(shí)感染對(duì)Pg、Aa粘附和入侵牙齦上皮細(xì)胞能力的影響,以及對(duì)牙齦上皮細(xì)胞IL-8的生成和hBD-2表達(dá)的影響。Pg、Aa單獨(dú)粘附和入侵牙齦上皮細(xì)胞,以及Pg、 Aa與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵牙齦上皮細(xì)胞的能力均被檢測(cè)。此外,Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染牙齦上皮細(xì)胞時(shí),利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)分別測(cè)定牙齦上皮細(xì)胞IL-8和hBD-2的表達(dá)。方法1、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵Ca9-22細(xì)胞能力的研究牙齦上皮細(xì)胞接種于12孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞密度為2.0×105／孔,每孔lml。在致感染之前,細(xì)胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS, pH7.4)洗兩遍,用無(wú)抗生素的最小必需培養(yǎng)基(minimal essential medium, MEM)培養(yǎng)2小時(shí)。三種不同的菌種接種于腦心浸液肉湯(Sigma, USA)上,補(bǔ)充0.5%的酵母提取物,氯化血紅素(5μg/ml)和維生素K1(5μg/ml),細(xì)菌培養(yǎng)2天直到OD660nm達(dá)到1-0。經(jīng)PBS洗過(guò)之后,菌細(xì)胞懸浮于MEM。細(xì)菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿(mǎn)的單層Ca9-22細(xì)胞中,在37℃、 5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。在粘附部分的檢測(cè)中,細(xì)菌與單層Ca9-22細(xì)胞孵育1小時(shí),然后單層細(xì)胞用PBS洗四遍,去除未粘附的細(xì)菌。接下來(lái)每孔加入1ml的無(wú)菌蒸餾水用于裂解細(xì)胞達(dá)90分鐘,將溶解產(chǎn)物稀釋1000倍,接種于腦心浸液血瓊脂平板(Brain Heart Infusion agar-Supplemented,BHI-S),每板100μ1菌液,在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。在入侵部分的檢測(cè)中,細(xì)菌與單層Ca9-22細(xì)胞孵育4小時(shí)。在接下來(lái)的孵育過(guò)程中,單層細(xì)胞用PBS洗四遍,去除未粘附的細(xì)菌,接種于含200μg/ml甲硝唑和300μg/ml的慶大霉素的MEM中培養(yǎng)1小時(shí),殺滅粘附于細(xì)胞外面的細(xì)菌。暴露于抗生素之后,單層細(xì)胞經(jīng)PBS洗兩遍,用每孔1ml的無(wú)菌蒸餾水裂解細(xì)胞90分鐘。將溶解產(chǎn)物稀釋100倍,接種于BHI-S血瓊脂平板,每板100μl菌液,在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)10天。粘附和入侵的微生物所形成的菌落形成單位按照接下來(lái)的孵育狀況進(jìn)行計(jì)算,細(xì)菌粘附和入侵的能力用細(xì)胞溶菌作用后重新獲得的細(xì)菌相對(duì)于起初加入的細(xì)菌總量的百分率表示。2、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染Ca9-22細(xì)胞時(shí)IL-8和hBD-2表達(dá)的研究為了檢測(cè)Ca9-22細(xì)胞所分泌的IL-8的總量,細(xì)菌懸液(2.0×107/孔)加入鋪滿(mǎn)Ca9-22的單層細(xì)胞中37℃、5%CO2孵育4小時(shí)。然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,-20℃保存。ELISA定量分析細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-8的濃度,用鼠IL-8單克隆抗體(1:100, Dako)作為捕獲抗體包被微孔板。重組IL-8或在測(cè)試樣品中捕獲的鼠抗體通過(guò)加入的兔IL-8多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè),隨即加入生物素化的羊抗兔IgG (1:200, Dako)和鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)以及HRP底物2,2'-聯(lián)氮基雙。37℃孵育45分鐘,測(cè)試樣品中IL-8的濃度通過(guò)已知濃度的重組β溶血性鏈球菌(beta-hemolytic streptococcal, BHS)和IL-8所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得。從Ca9-22細(xì)胞提取的總RNA(2微克)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,使用(dT)18和SuperscriptⅡ酶(Invitrogen),反應(yīng)混合物25微升,42℃反應(yīng)1小時(shí)。在20微升體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,反應(yīng)混合物含有1微升模板cDNA、SYBR Premix Ex Taq、ROX Reference Dye (Sigma, USA)和每一種引物(0.2微摩爾)。使用的引物序列是：GAPDH正向引物,5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'和反向引物5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3'; hBD-2正向引物5'-AGACTCAGCTCCTGGTCAAGCTC-3'和反向引物5’-TGGCTCCACTCTTAAGGCAGGTA-3'。為了防止擴(kuò)增出污染的基因組DNA,所有的引物被設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增至少兩個(gè)外顯子。擴(kuò)增在熒光熱循環(huán)儀(StepOne Plus)中按照以下條件進(jìn)行：94℃預(yù)變性1分鐘,然后是95℃變性15秒、62℃退火15秒和72℃延伸33秒,共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析和3%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。在目的基因擴(kuò)增的同時(shí)也擴(kuò)增管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),使用2-△CT計(jì)算相比GAPDH的相對(duì)拷貝數(shù)。結(jié)果1、Pg, Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí)粘附和入侵Ca9-22細(xì)胞能力的研究Pg、Aa和Fn單獨(dú)粘附細(xì)胞的能力分別是0.97±0.38%,2.62±0.58%和1.06±0.30%。Pg與Fn相互共聚、同時(shí)感染時(shí),Pg粘附Ca9-22的能力被明顯增強(qiáng)至兩倍(P0.05)。Aa粘附Ca9-22細(xì)胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比A2處理組約升高178.24%(P0.05)。這些結(jié)果顯示與Fn共同孵育后的Pg、Aa粘附Ca9-22細(xì)胞的能力被增強(qiáng),然而這樣的效果可以被Fn的粘附、入侵抑制劑半乳糖所抑制。Pg、Aa和Fn單獨(dú)入侵細(xì)胞的能力分別是0.35±0.08%,1.01±0.15%和0.44±0.11%。Pg、Aa入侵Ca9-22細(xì)胞的能力在Fn存在的狀態(tài)下比缺乏Fn時(shí)分別顯著增強(qiáng)251.43%和207.92%(P0.05)。這些結(jié)果表明Fn能夠有效增強(qiáng)Pg、Aa入侵Ca9-22細(xì)胞的能力,然而這樣的效果可以被半乳糖所抑制。2、Pg、Aa單獨(dú)或與Fn相互共聚、同時(shí)感染Ca9-22細(xì)胞時(shí)IL-8和hBD-2表達(dá)的研究在單種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中,A3處理組中Ca9-22細(xì)胞的IL-8產(chǎn)生量最高(428.75 pg/ml),相反的,IL-8產(chǎn)生量最低的為A1處理組(386.66 pg/ml)。在多種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中,與A3處理組相比,B1和B2處理組中IL-8的產(chǎn)生量分別降低6.12%和8.05%。而在C1-C4處理組中,IL-8的產(chǎn)生量均比B1-B4處理組輕度升高(P0.05)。在單種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中,A3處理組中Ca9-22細(xì)胞hBD-2 mRNA的表達(dá)最高(0.48),相反的,hBD-2 mRNA表達(dá)最低的為A1處理組(0.26)。在多種細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)中,與A3處理組相比,B1和B2處理組中hBD-2 mRNA的表達(dá)分別降低66.94%和51.39%。與此同時(shí),在C1-C4處理組中,hBD-2 mRNA的表達(dá)均相應(yīng)的比B1-B4處理組有所升高(P0.05)。結(jié)論1、與Fn共聚后,Pg和Aa粘附、入侵牙齦上皮細(xì)胞的能力被增強(qiáng),增強(qiáng)效果可以被半乳糖所抑制。2、與Fn共聚后的Pg和Aa下調(diào)牙齦上皮細(xì)胞IL-8的生成和hBD-2的表達(dá),下調(diào)程度可以被半乳糖所抑制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1739333