本文選題：基于　切入點：間充　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：在口腔的腫瘤中,90%以上為口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)(Choi et al.,2008),而在口腔鱗狀細胞癌中,舌鱗癌(tougue squamous cell carcinoma,TSCC)占80%。雖然口腔鱗癌的標準化治療方法仍然在不斷改進,但近十年的死亡率仍未發(fā)生改變,5年生存率在50%左右(Marsh D,2011)。近年來,學(xué)者們一直在尋求一種新的治療策略——靶向分子治療,即找到僅對腫瘤組織有殺傷作用而對正常組織無殺傷作用的生物制劑或細胞因子和能靶向到達腫瘤組織的載體的理想結(jié)合。TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族成員之一,是一種能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞凋亡而對正常細胞無害的2型跨膜蛋白,已有多項研究證實了重組TRAIL蛋白的抗腫瘤活性(Ashkenazi A,1999; Ciavarella et al.,2012),是最有潛力成為腫瘤治療的理想分子,然而因其藥物半衰期短,要想達到理想的治療效果就需要頻繁大劑量的給藥。因此還需要一種能將TRAIL蛋白靶向持續(xù)輸送到腫瘤組織內(nèi)的載體。因有研究發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs (bone marrow derived mesenchymal stem/stromal cells, BM-MSCs)能向腫瘤組織歸巢,而使學(xué)者們想到利用MSCs作為細胞載體,通過基因修飾的方法來靶向輸送TRAIL蛋白,并在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌以及黑色素瘤等動物模型中展示出有效的抑瘤作用(Studeny et al.,2002; Nakamura et al.,2004; Schichor C et al.,2006; Dwyer et al.,2007; Bak et al.,2011)。但與BM-MSCs相比,牙齦來源的MSCs (gingiva-derived MSCs, G-MSCs)具有不少優(yōu)勢,比如容易分離培養(yǎng),細胞均一性好,體外培養(yǎng)過程中不依賴生長因子且增殖較快,多次傳代后仍然保持穩(wěn)定的形態(tài)和生物學(xué)性能。此外,G-MSCs長期培養(yǎng)后依然能保持正常的染色體組型和端粒酶活性,不表現(xiàn)成瘤性(Tomar et al.,2010)。 G-MSCs是否也能向腫瘤組織歸巢,替代BM-MSCs而成為理想的細胞工具?本研究旨在探索G-MSCs是否具有向TSCC趨化的特性,并進一步構(gòu)建穩(wěn)定表達TRAIL蛋白的G-MSCs細胞載體(G-MSCFLT),即’TRAIL蛋白的靶向緩釋系統(tǒng),體、內(nèi)外探討G-MSCFLT抑制TSCC生長的作用。研究內(nèi)容分外三大部分： 第一部分 G-MSCs對舌鱗癌細胞歸巢現(xiàn)象的體外研究 目的體外研究G-MSCs向舌鱗癌細胞系的趨化能力。方法用組織塊的原代細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)、擴增牙齦細胞,再采用Stro-1免疫磁珠篩選的方法,從牙齦細胞中分離G-MSCS。采用Transwell培養(yǎng)板研究G-MSCs向舌鱗癌細胞系的遷移能力。結(jié)果牙齦組織中原代培養(yǎng),純化的G-MSCs呈成纖維樣細胞,具有多項分化能力(成骨,成脂)。遷移實驗表明：與空白組(65.8±14.8)和陰性對照組(115.6±7.6)相比,該細胞向舌鱗癌細胞系Tca8113和Cal27遷移顯著增加(Cal27:466.8±30.4; Tca8113:416.8±19.4cells/field)(P0.001, ANOVA)。結(jié)論G-MSCs能顯著向舌鱗癌細胞系Tca8113和Cal27遷移。 第二部分 TRAIL基因修飾的G-MSCs載體的構(gòu)建 目的構(gòu)建能穩(wěn)定表達TRAIL蛋白的G-MSCs細胞載體。方法以pLL3.7為骨架,通過酶切、連接的方法將TRAIL基因全長插入到CMV啟動子和GFP之間,TRAIL基因與GFP之間通過2A列相連,構(gòu)建成表達TRAIL基因的表達質(zhì)粒(pLLT)。 pLLT/pMD2.G/psPAX2三質(zhì)粒系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)染試齊(?)Lipofectamin2000TM在293FT細胞里包裝成慢病毒命名為LV-pLLT; pLL3.7/pMD2.G/psPAX2三質(zhì)粒系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000TM在293FT細胞里包裝成的慢病毒命名為LV-pLL3.7,作為陰性對照。再用LV-pLLT感染G-MSCs,通過病毒感染的方法將TRAIL基因全長整合到G-MSCs的基因組里,構(gòu)建出的表達TRAIL蛋白的細胞載體即為G-MSCFLT,用LV-pLL3.7感染G-MSCs即為G-MSCFL,為空載體,作為陰性對照。通過流式檢測感染效率,用免疫熒光、Western-Blot以及ELISA檢測TRAIL蛋白的表達。結(jié)果通過慢病毒感染的方法將TRAIL整合進G-MSCs的基因組的效率高達88.66%±0.13%, G-MSCFLT能穩(wěn)定表達TRAIL蛋白。結(jié)論通過慢病毒感染的方法能成功高效地構(gòu)建穩(wěn)定表達TRAIL蛋白的G-MSCs細胞載體。 第三部分 TRAIL基因修飾的G-MSCs抑癌作用的體、內(nèi)外實驗研究 目的體內(nèi)、外研究TRAIL基因修飾的G-MSCs對TSCC的生長抑制作用方法將舌鱗癌細胞系(Tca8113和Cal27)與G-MSCFLT體外(1：1)直接共培養(yǎng),采用凋亡染色試劑盒(Annexin V-PE/7-ADD Kit)在流式細胞儀上檢測G-MSCFLT對舌鱗癌細胞系的凋亡誘導(dǎo)作用。Tca8113和Cal27與G-MSCFL共培養(yǎng)組則為陰性對照組。體內(nèi)抗瘤作用以裸鼠為動物模型,選用Tca8113腫瘤細胞,通過局部(與腫瘤細胞混合注射和瘤體內(nèi)注射)及系統(tǒng)(尾靜脈注射)兩種途徑移植G-MSCFLT,通過瘤體的大小及TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測腫瘤切片中腫瘤細胞凋亡的情況來評估其抑瘤作用。結(jié)果體外實驗表明,G-MSCFLT能顯著誘導(dǎo)舌鱗癌細胞(Tca8113和Ca127)凋亡(Tca8113:48.45%±3.56%vs.17.82%±3.03%,P0.01, ANOVA)(Cal27:52.63±16.03vs15.92±10.64,P0.01,ANOVA)。動物實驗表明,在混合注射移植途徑中,G-MSCFLT/G-MSCFL與舌鱗癌細胞均以5×105混合物注射時,G-MSCFLT組無瘤體形成。將G-MSCFLT與Tca8113分別以5×105與1×106混合物注射時,G-MSCFLT組有瘤體形成,但與空白組相比,腫瘤重量明顯減小(85±42.72mg vs.738±430.49mg;P0.01,Kruskal-Wallis).在瘤體內(nèi)注射移植途徑中,G-MSCFLT組瘤體重量與G-MSCFL組相比無明顯差異(124±60.66mg vs.370±217.41mg,P0.05,KruskaI-Walli),但與空白對照組相比,重量顯著減小(124±60.66mg vs.738±430.49mg；P0.01,Kruskal-Wallis).在尾靜脈注射系統(tǒng)移植途徑中,G-MSCFLT組瘤體重量顯著低于G-MSCFL組(45.00±23.80mg vs.125.00±51.96mg；P0.05,Kruskal-Wlallis).在瘤體的組織切片中也能檢測到G-MSCFLT的存在,以及相應(yīng)TRAIL蛋白的表達,并檢測到TRAIL蛋白表達的部位有大量腫瘤細胞凋亡。結(jié)論G-MSCFLT能遷移到腫瘤組織內(nèi),并表達TRAIL蛋白,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,從而抑制腫瘤的生長。G-MSCs是攜帶TRAIL基因治療舌鱗癌的有效靶向細胞載體,可用于舌鱗癌的基因治療,并為其臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.86

【參考文獻】

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1 云濤;倪征;余斌;陳柳;華炯鋼;王根榮;張彥明;劉光清;;含F(xiàn)MDV 2A序列PRRSV GP5和M蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年08期

2 鄧啟垣;陳燦;黃石安;;間充質(zhì)干細胞歸巢的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年05期

3 馮長根;周漢生;;TRAIL促腫瘤細胞凋亡的研究進展[J];中國藥學(xué)雜志;2006年08期

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本文編號：1721161