本文選題：CREB　切入點：根尖牙乳頭干細胞　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：近年來,干細胞生物學和組織工程學發(fā)展迅速,這促進了再生性醫(yī)學的進步。再生性醫(yī)學的目的是創(chuàng)造功能性、有活力的組織,修復或取代受損的組織。在牙體牙髓科中,根尖牙乳頭干細胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla)是研究的熱點,它存在于未發(fā)育完全的恒牙根尖周組織中,是具有高度增生自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞,被認為是牙根部成牙本質(zhì)細胞的來源,最終形成牙根部牙本質(zhì)。SCAPs的存在解釋了一些被感染的年輕恒牙經(jīng)過適當?shù)南咎幚砗?牙根仍能繼續(xù)發(fā)育的現(xiàn)象。cAMP/PKA/CREB信號通路可以決定間充質(zhì)干細胞的成骨向分化潛力。作為該通路的下游信號,CREB(c AMP responsive element-binding protein)起了關鍵作用,它通過附著于c AMP(cyclic Adenosine 3',5'-monophosphate)反應基因的保守序列而發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類磨牙成牙本質(zhì)細胞和成牙骨質(zhì)細胞的細胞核內(nèi),CREB表達明顯,而抑制CREB后,小鼠的軟骨內(nèi)骨形成減少。此外,在許多與礦化過程相關基因的啟動子區(qū)域內(nèi),含有轉錄因子CREB在靶基因上的結合位點CRE,如骨鈣素(OCN,osteocalcin),骨涎蛋白(BSP,bone sialoprotein)等。提示CREB在生物礦化的過程中起了重要作用,然而,在SCAPs中,CREB對于成牙本質(zhì)/成骨分化的作用還未完全確定。目的通過慢病毒轉染人根尖牙乳頭干細胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla),改變轉錄因子CREB(c AMP-responsive element binding protein)在SCAPs中的表達,檢測對SCAPs成牙本質(zhì)/成骨向分化的影響,從而探討CREB定向調(diào)控根尖牙乳頭干細胞分化的分子機制。方法分離培養(yǎng)人根尖牙乳頭干細胞;采用有限稀釋法獲得克隆化細胞;流式細胞術和細胞多向分化誘導實驗鑒定實驗細胞的組織學來源;分別構建慢病毒載體介導的CREB基因過表達和沉默的根尖牙乳頭干細胞;實時定量PCR和Western Blot檢測慢病毒轉染效率。預實驗確立各組慢病毒MOI(Multiply of Infection)值及最佳轉染條件。將細胞分組為空白對照組、陰性病毒對照組、過表達組、沉默組。將空白對照組、病毒對照組、CREB過表達/沉默組礦化誘導2周后,茜素紅染色觀察比較礦化結節(jié)形成的量,并半定量分析;實時定量PCR檢測礦化誘導1、2、3周時,各組細胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphateasea,ALP),Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ),runt相關轉錄因子2(RUNX2),骨鈣素(osteocalcin,OCN),osterix(OSX)的m RNA表達;對各組細胞礦化誘導3周后,Western Blot檢測成牙本質(zhì)特異性蛋白DSP(dentin sialoprotein)及成骨分化標志物RUNX2的表達,并進行蛋白半定量分析。結果流式細胞術和干細胞多向分化實驗證實分離培養(yǎng)的細胞為SCAPs。實時定量PCR和Western Blot檢測顯示慢病毒轉染SCAPs后能夠有效改變目的基因CREB表達,結合熒光顯微鏡觀察說明慢病毒具有很高的轉染效率,且對細胞生長無明顯影響。茜素紅染色及礦化結節(jié)半定量分析顯示,礦化誘導2周后,CREB過表達組形成鈣結節(jié)能力增強;礦化誘導1、2、3周,CREB過表達組中的礦化標志物ALP,Col-Ⅰ,RUNX2,OCN,OSX的m RNA在各時間點幾乎均上升;Western Blot檢測礦化誘導3周時的細胞示,CREB過表達組DSP,RUNX2蛋白表達升高(P0.05)。而CREB沉默組形成鈣結節(jié)能力則減弱(P0.05),且在礦化誘導4、7天時檢測,礦化基因的m RNA均有不同程度的降低(P0.05)。結論在SCAPs礦化誘導過程中,過表達CREB促進SCAPs向成牙/成骨細胞分化,而沉默CREB則發(fā)揮相反作用,提示CREB可能促進SCAPs的定向分化能力。為牙源性干細胞在牙髓/牙本質(zhì)再生和生物性牙根的形成提供新的思路。
[Abstract]:In recent years, stem cell biology and tissue engineering develops rapidly, which promotes the regeneration of the progress of medicine. Medical regeneration is to create functional, vibrant organization, repair or replace damaged tissue. In the Department of endodontics, SCAP (SCAPs, stem cells from the apical papilla) is a hotspot of research, it exists in immature permanent teeth in periapical tissues, is highly proliferative self-renewal and multilineage differentiation potential of adult stem cells, is considered to be the root source of odontoblasts, finally form the root dentin.SCAPs exists to explain some of the infected young permanent teeth after disinfection treatment after appropriate, the phenomenon of.CAMP/PKA/CREB signaling pathway can continue to root development can determine mesenchymal stem cells and osteogenic differentiation potential. As the downstream signal pathway, CREB (C AMP Responsive element-binding protein) played a key role, it attached to the C AMP (cyclic Adenosine 3', 5'-monophosphate) conserved sequence response genes play a role. Have been found in human molar odontoblasts and cementum cell nucleus, the expression of CREB significantly, and the inhibition of CREB mice after endochondral bone formation decreased. In addition, the promoter region in many mineralization related genes, containing CRE binding sites of transcription factor CREB in the target genes, such as Osteocalcin (OCN, osteocalcin), bone sialoprotein (BSP, bone, sialoprotein). CREB plays an important role in the process of biomineralization, however, in SCAPs, CREB for odontogenic / osteogenic differentiation has not been fully established. The purpose of stem cells by lentivirus transfected SCAP (SCAPs, stem cells from the apical papilla), the change of transcription factors CREB (C AMP-responsive element binding protein) expression in SCAPs, detection of SCAPs odontoblast / osteogenic differentiation effect, so as to explore the molecular mechanism of CREB cell differentiation and regulation of directional SCAP. Isolation and culture of human SCAP method; acquired cell cloned by limited dilution method; the source of flow cytometry and differentiation induced by experimental identification of experimental cells respectively; construction of CREB gene lentiviral vector mediated over expression and silencing of the apical papilla stem cells; quantitative real-time PCR and Western detection of Blot lentiviral transfection efficiency. The pre experiment establishment of lentiviral MOI groups (Multiply of Infection) value and the optimal transfection conditions. The cells were divided into control group, negative control virus group, overexpression group, silence will group. The blank control group, virus control group, over expression of CREB / silent group induced mineralization By 2 weeks, alizarin red staining to observe and compare the formation of mineralized nodules, and semi quantitative analysis; real-time quantitative PCR detection of mineralization induced by 1,2,3 weeks, the cells were alkaline phosphatase (alkaline phosphateasea, ALP), collagen type I (collagen type I, Col- I), runt related transcription factor 2 (RUNX2). Osteocalcin (osteocalcin, OCN), osterix (OSX) expression of M RNA; to each cell mineralization after 3 weeks of induction, Western Blot detection of odontoblast specific protein DSP (dentin sialoprotein) and osteogenic differentiation marker RUNX2 expression, and semi quantitative analysis of protein. The results of flow cytometry and multipotential stem cell differentiation experiments confirmed that the cultured cells showed that lentiviral transfection of SCAPs SCAPs. and Western Blot real-time quantitative PCR detection can effectively change the gene expression of CREB, combined with fluorescence microscopy that lentivirus with high transfection efficiency, The growth and has no obvious effect on the cells. Semi quantitative alizarin red staining and mineralized nodules analysis showed that 2 weeks after the induction of CREB mineralization, formation of calcium nodules and enhance the ability of expression; mineralization induced by 1,2,3 weeks, over expression of CREB in the group of mineralization markers ALP, Col- 1, RUNX2, OCN, m RNA OSX in the almost all time points showed rise; at 3 weeks of Western cells induced by Blot detection of mineralization, overexpression of CREB group DSP, RUNX2 protein expression increased (P0.05). CREB silencing group calcium nodules formation ability decreased (P0.05), and the detection in mineralization induced 4,7 days, decrease mineralization gene of M RNA was different the (P0.05). Conclusion in SCAPs induced mineralization process, overexpression of CREB promotes SCAPs into the tooth / osteoblast differentiation, whereas knockdown of CREB will play the opposite effect, suggesting that CREB may promote the differentiation ability of SCAPs. For dental stem cells in dental pulp / dentin regeneration and biological The formation of the root provides a new way of thinking.

【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781

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本文編號：1707962