本文選題：CREB　切入點(diǎn)：根尖牙乳頭干細(xì)胞　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：近年來(lái),干細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)發(fā)展迅速,這促進(jìn)了再生性醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。再生性醫(yī)學(xué)的目的是創(chuàng)造功能性、有活力的組織,修復(fù)或取代受損的組織。在牙體牙髓科中,根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla)是研究的熱點(diǎn),它存在于未發(fā)育完全的恒牙根尖周組織中,是具有高度增生自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,被認(rèn)為是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源,最終形成牙根部牙本質(zhì)。SCAPs的存在解釋了一些被感染的年輕恒牙經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南咎幚砗?牙根仍能繼續(xù)發(fā)育的現(xiàn)象。cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路可以決定間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化潛力。作為該通路的下游信號(hào),CREB(c AMP responsive element-binding protein)起了關(guān)鍵作用,它通過(guò)附著于c AMP(cyclic Adenosine 3',5'-monophosphate)反應(yīng)基因的保守序列而發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類磨牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),CREB表達(dá)明顯,而抑制CREB后,小鼠的軟骨內(nèi)骨形成減少。此外,在許多與礦化過(guò)程相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi),含有轉(zhuǎn)錄因子CREB在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)CRE,如骨鈣素(OCN,osteocalcin),骨涎蛋白(BSP,bone sialoprotein)等。提示CREB在生物礦化的過(guò)程中起了重要作用,然而,在SCAPs中,CREB對(duì)于成牙本質(zhì)/成骨分化的作用還未完全確定。目的通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染人根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla),改變轉(zhuǎn)錄因子CREB(c AMP-responsive element binding protein)在SCAPs中的表達(dá),檢測(cè)對(duì)SCAPs成牙本質(zhì)/成骨向分化的影響,從而探討CREB定向調(diào)控根尖牙乳頭干細(xì)胞分化的分子機(jī)制。方法分離培養(yǎng)人根尖牙乳頭干細(xì)胞;采用有限稀釋法獲得克隆化細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鑒定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的組織學(xué)來(lái)源;分別構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的CREB基因過(guò)表達(dá)和沉默的根尖牙乳頭干細(xì)胞;實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。預(yù)實(shí)驗(yàn)確立各組慢病毒MOI(Multiply of Infection)值及最佳轉(zhuǎn)染條件。將細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、陰性病毒對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組、沉默組。將空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、CREB過(guò)表達(dá)/沉默組礦化誘導(dǎo)2周后,茜素紅染色觀察比較礦化結(jié)節(jié)形成的量,并半定量分析;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)礦化誘導(dǎo)1、2、3周時(shí),各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphateasea,ALP),Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ),runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2),骨鈣素(osteocalcin,OCN),osterix(OSX)的m RNA表達(dá);對(duì)各組細(xì)胞礦化誘導(dǎo)3周后,Western Blot檢測(cè)成牙本質(zhì)特異性蛋白DSP(dentin sialoprotein)及成骨分化標(biāo)志物RUNX2的表達(dá),并進(jìn)行蛋白半定量分析。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)和干細(xì)胞多向分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為SCAPs。實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)顯示慢病毒轉(zhuǎn)染SCAPs后能夠有效改變目的基因CREB表達(dá),結(jié)合熒光顯微鏡觀察說(shuō)明慢病毒具有很高的轉(zhuǎn)染效率,且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)半定量分析顯示,礦化誘導(dǎo)2周后,CREB過(guò)表達(dá)組形成鈣結(jié)節(jié)能力增強(qiáng);礦化誘導(dǎo)1、2、3周,CREB過(guò)表達(dá)組中的礦化標(biāo)志物ALP,Col-Ⅰ,RUNX2,OCN,OSX的m RNA在各時(shí)間點(diǎn)幾乎均上升;Western Blot檢測(cè)礦化誘導(dǎo)3周時(shí)的細(xì)胞示,CREB過(guò)表達(dá)組DSP,RUNX2蛋白表達(dá)升高(P0.05)。而CREB沉默組形成鈣結(jié)節(jié)能力則減弱(P0.05),且在礦化誘導(dǎo)4、7天時(shí)檢測(cè),礦化基因的m RNA均有不同程度的降低(P0.05)。結(jié)論在SCAPs礦化誘導(dǎo)過(guò)程中,過(guò)表達(dá)CREB促進(jìn)SCAPs向成牙/成骨細(xì)胞分化,而沉默CREB則發(fā)揮相反作用,提示CREB可能促進(jìn)SCAPs的定向分化能力。為牙源性干細(xì)胞在牙髓/牙本質(zhì)再生和生物性牙根的形成提供新的思路。
[Abstract]:In recent years, stem cell biology and tissue engineering develops rapidly, which promotes the regeneration of the progress of medicine. Medical regeneration is to create functional, vibrant organization, repair or replace damaged tissue. In the Department of endodontics, SCAP (SCAPs, stem cells from the apical papilla) is a hotspot of research, it exists in immature permanent teeth in periapical tissues, is highly proliferative self-renewal and multilineage differentiation potential of adult stem cells, is considered to be the root source of odontoblasts, finally form the root dentin.SCAPs exists to explain some of the infected young permanent teeth after disinfection treatment after appropriate, the phenomenon of.CAMP/PKA/CREB signaling pathway can continue to root development can determine mesenchymal stem cells and osteogenic differentiation potential. As the downstream signal pathway, CREB (C AMP Responsive element-binding protein) played a key role, it attached to the C AMP (cyclic Adenosine 3', 5'-monophosphate) conserved sequence response genes play a role. Have been found in human molar odontoblasts and cementum cell nucleus, the expression of CREB significantly, and the inhibition of CREB mice after endochondral bone formation decreased. In addition, the promoter region in many mineralization related genes, containing CRE binding sites of transcription factor CREB in the target genes, such as Osteocalcin (OCN, osteocalcin), bone sialoprotein (BSP, bone, sialoprotein). CREB plays an important role in the process of biomineralization, however, in SCAPs, CREB for odontogenic / osteogenic differentiation has not been fully established. The purpose of stem cells by lentivirus transfected SCAP (SCAPs, stem cells from the apical papilla), the change of transcription factors CREB (C AMP-responsive element binding protein) expression in SCAPs, detection of SCAPs odontoblast / osteogenic differentiation effect, so as to explore the molecular mechanism of CREB cell differentiation and regulation of directional SCAP. Isolation and culture of human SCAP method; acquired cell cloned by limited dilution method; the source of flow cytometry and differentiation induced by experimental identification of experimental cells respectively; construction of CREB gene lentiviral vector mediated over expression and silencing of the apical papilla stem cells; quantitative real-time PCR and Western detection of Blot lentiviral transfection efficiency. The pre experiment establishment of lentiviral MOI groups (Multiply of Infection) value and the optimal transfection conditions. The cells were divided into control group, negative control virus group, overexpression group, silence will group. The blank control group, virus control group, over expression of CREB / silent group induced mineralization By 2 weeks, alizarin red staining to observe and compare the formation of mineralized nodules, and semi quantitative analysis; real-time quantitative PCR detection of mineralization induced by 1,2,3 weeks, the cells were alkaline phosphatase (alkaline phosphateasea, ALP), collagen type I (collagen type I, Col- I), runt related transcription factor 2 (RUNX2). Osteocalcin (osteocalcin, OCN), osterix (OSX) expression of M RNA; to each cell mineralization after 3 weeks of induction, Western Blot detection of odontoblast specific protein DSP (dentin sialoprotein) and osteogenic differentiation marker RUNX2 expression, and semi quantitative analysis of protein. The results of flow cytometry and multipotential stem cell differentiation experiments confirmed that the cultured cells showed that lentiviral transfection of SCAPs SCAPs. and Western Blot real-time quantitative PCR detection can effectively change the gene expression of CREB, combined with fluorescence microscopy that lentivirus with high transfection efficiency, The growth and has no obvious effect on the cells. Semi quantitative alizarin red staining and mineralized nodules analysis showed that 2 weeks after the induction of CREB mineralization, formation of calcium nodules and enhance the ability of expression; mineralization induced by 1,2,3 weeks, over expression of CREB in the group of mineralization markers ALP, Col- 1, RUNX2, OCN, m RNA OSX in the almost all time points showed rise; at 3 weeks of Western cells induced by Blot detection of mineralization, overexpression of CREB group DSP, RUNX2 protein expression increased (P0.05). CREB silencing group calcium nodules formation ability decreased (P0.05), and the detection in mineralization induced 4,7 days, decrease mineralization gene of M RNA was different the (P0.05). Conclusion in SCAPs induced mineralization process, overexpression of CREB promotes SCAPs into the tooth / osteoblast differentiation, whereas knockdown of CREB will play the opposite effect, suggesting that CREB may promote the differentiation ability of SCAPs. For dental stem cells in dental pulp / dentin regeneration and biological The formation of the root provides a new way of thinking.

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781

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本文編號(hào)：1707962