本文選題：外胚間充質(zhì)干細胞　切入點：牙向分化　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：長期以來,因齲病、牙周病、創(chuàng)傷等原因造成的牙齒缺失對人類造成較大的困擾,包括種植牙在內(nèi)的各種缺失牙修復(fù)方法各有其局限,尚不能完全恢復(fù)缺牙患者的生理和心理功能。牙組織工程和牙再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)提供了一條更為適宜的思路,即重新啟動牙齒發(fā)育進程,以修復(fù)牙體、牙周組織缺損,直至全牙再生。在牙組織工程中,適宜種子細胞的選擇是組織工程三要素中最為重要的內(nèi)容。神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)和外胚層來源的上皮細胞的連續(xù)相互作用貫穿于牙形態(tài)發(fā)生的始終。在經(jīng)典的牙發(fā)育理論中,牙齒的發(fā)生是由這兩個胚層細胞經(jīng)復(fù)雜的上皮-間充質(zhì)相互作用,并伴隨著按嚴(yán)格時-空順序表達的信號分子“瀑布”調(diào)控完成的。在胚胎發(fā)育早期,神經(jīng)嵴細胞從中、后腦的神經(jīng)嵴經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、脫層后遷移至第一腮弓,并組成第一腮弓的大部分組織,此時稱為外胚間充質(zhì)干細胞。牙板形成后,牙齒發(fā)育開始啟動,牙板上皮來源的信號分子傳遞至其下方神經(jīng)嵴來源的EMSCs,引起其增殖、凝聚,經(jīng)牙板期、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等明確的牙齒發(fā)育階段,在釉質(zhì)形成后,牙根發(fā)育啟動并最終萌出至咬合平面,完成牙齒的發(fā)育。在這一過程中,神經(jīng)嵴來源的EMSCs形成了除牙冠釉質(zhì)外全部牙體組織結(jié)構(gòu),包括其派生的牙乳頭間充質(zhì)細胞,其最終分化為成牙本質(zhì)細胞并分泌基質(zhì),形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體、以及其派生的牙囊祖細胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs)最終形成的牙骨質(zhì)、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可見,牙齒發(fā)育早期的EMSCs具有雙向分化特性,即向成牙本質(zhì)細胞和牙囊祖細胞及其子代細胞分化的特性,理論上EMSCs作為牙組織工程的種子細胞,具有形成除釉質(zhì)外牙齒全部結(jié)構(gòu)的能力。但這一胚胎發(fā)育過渡性的干細胞在體外誘導(dǎo)環(huán)境下,是否具有牙向分化能力,尚待進一步明確。再者,目前牙發(fā)育相關(guān)研究表明,尚有非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)參與牙形態(tài)發(fā)生,牙組織工程相關(guān)研究也提示,除了神經(jīng)嵴來源的牙齒間充質(zhì)干細胞,非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細胞,如骨髓間充質(zhì)干細胞等也可表達牙向分化能力。神經(jīng)嵴源性和非神經(jīng)嵴源性的間充質(zhì)干細胞作為牙組織工程的種子細胞,哪一個更為適宜,尚無明確定論。因此,目前有三個亟待解決的問題:(1)神經(jīng)嵴來源的EMSCs在體外牙向誘導(dǎo)環(huán)境下是否具有牙向分化能力?(2)神經(jīng)嵴來源的emscs作為種子細胞,和非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細胞比較,其成牙潛能如何?(3)牙胚的發(fā)生是通過口腔上皮與顱頜神經(jīng)嵴來源emscs細胞間的信號分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、進而推動的復(fù)雜發(fā)育過程,而胚胎發(fā)育早期emscs參與牙齒發(fā)育的內(nèi)在分子調(diào)控機制尚待進一步明確。因此,研究牙發(fā)育早期emscs的成牙潛能和內(nèi)在分子機制,可以為完善牙發(fā)育學(xué)理論,以及為牙組織工程的種子細胞選擇和構(gòu)建組織工程牙胚,提供初步的依據(jù)和策略。主要研究內(nèi)容和結(jié)果目的:本課題主要對比研究大鼠胚胎11.5d(e11.5d)第一腮弓神經(jīng)嵴來源的emscs和非神經(jīng)嵴來源的emscs,在體外、體內(nèi)成牙誘導(dǎo)微環(huán)境下的成牙潛能差異;利用細胞凝聚技術(shù)還原牙齒器官發(fā)育模式,從上皮-間充質(zhì)相互作用和牙發(fā)育角度探討明確的神經(jīng)嵴來源的emscs在體外、體內(nèi)的牙向分化模式;進一步以基因芯片技術(shù)探討神經(jīng)嵴來源的emscs在牙向分化過程中可能存在的分子機制,為牙發(fā)育機制和牙組織工程再生提供可能的理論依據(jù)和策略。方法:1.為明確p75-ntr標(biāo)記的emscs在牙發(fā)育中的時空變化,我們通過對e11.5-e18.5d大鼠胚胎牙齒不同發(fā)育階段的連續(xù)觀察,利用he和ihc技術(shù)對比觀察神經(jīng)嵴細胞的標(biāo)記物,p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75-neurotrophinreceptor,p75-ntr)以及胚胎干細胞標(biāo)記物oct4和sox2,在牙發(fā)育各個時期emscs中的時空表達和生物學(xué)功能;2.為獲取明確的神經(jīng)嵴來源的emscs,我們以流式細胞技術(shù)分選e11.5d大鼠胚胎第一腮弓來源的p75-ntr陽性emscs(p_(75)~+emscs),原代細胞培養(yǎng)后進行增殖能力檢測和干細胞鑒定;3.為明確p_(75)~+emscs是否具有牙向分化能力,及探討與非神經(jīng)嵴來源的p75-ntr陰性emscs(p75-emscs)的牙向分化能力差異,我們利用大鼠切牙頸環(huán)上皮干細胞系hat-7條件培養(yǎng)液和切牙頸環(huán)上皮干細胞,通過體外、體內(nèi)誘導(dǎo)模式對p75進行牙向分化誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)模式下以hat-7條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)0、4、8、12d后觀察細胞形態(tài)變化,透射電鏡(tem)檢測誘導(dǎo)前后的細胞超微結(jié)構(gòu)變化,流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化;對比p75和蛋白dsp、dmp1等變化;體內(nèi)誘導(dǎo)模式下,以原代大鼠切牙頸環(huán)上皮干細胞重組p_(75)~+emscs/p75-emscs(細胞比例2:3),以i型膠原蛋白為重組體支架,待細胞自發(fā)凝聚后,大鼠腎被膜下移植,4周后取材進行ihc鑒定成牙關(guān)鍵蛋白dsp和dmp1表達;4.為進一步探討神經(jīng)嵴和非神經(jīng)嵴來源的emscs牙向分化差異的分子機制,我們以基因芯片微陣列分析e11.5dp_(75)~+emscs和p75-emscs基因表達譜差異基因,kegg代謝通路分析牙發(fā)育相關(guān)信號通路。然后以sirna-smad4沉默p_(75)~+emscs的tgf-β信號通路關(guān)鍵蛋白smad4,smad4激活劑kartogenin激活p75-emscs的smad4表達,以上兩組細胞在hat-7條件培養(yǎng)液牙向分化誘導(dǎo)后,以westernblot檢測tgf-β信號通路關(guān)鍵蛋白smad4對p_(75)~+emscs和p75-emscs牙向分化能力的影響。結(jié)果:1.p75-ntr作為公認的神經(jīng)嵴細胞的標(biāo)記物,在牙齒各個發(fā)育時期的牙源性間充質(zhì)中都連續(xù)表達,可以作為神經(jīng)嵴來源的emscs的連續(xù)標(biāo)記物。其同時在牙上皮表達,顯示其參與了上皮和間充質(zhì)的相互作用;胚胎干細胞的標(biāo)記物oct4和sox2的表達在牙發(fā)育早期表達較弱,在牙發(fā)育后期(鐘狀期)的上皮-間充質(zhì)界面強烈表達,顯示其協(xié)同p75-ntr調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用;2.分選前emscs形態(tài)具有高度異質(zhì)性,顯示不同族群的細胞雜居生長。分選后的p_(75)~+emscs呈短梭三角形,形態(tài)趨于一致。p_(75)~+emscs分選比率為24.5%提示其在第一腮弓組織中有較高的比率。細胞增殖實驗顯示p_(75)~+emscs的增殖能力顯著高于p75-emscs。免疫熒光鑒定p_(75)~+emscs具備間充質(zhì)干細胞表面抗原(stro-1、vimintin)和神經(jīng)嵴細胞(p75-ntr,ap2α,hnk-1)雙重標(biāo)記物,同時胚胎源性標(biāo)記物oct4陽性,提示為具有神經(jīng)嵴源性和間充質(zhì)干細胞雙重特性的外胚間充質(zhì)干細胞(emscs);3.p_(75)~+emscs在體外成牙誘導(dǎo)模式下細胞形態(tài)、細胞周期、細胞增殖、細胞超微結(jié)構(gòu)變化以及高表達成牙本質(zhì)細胞標(biāo)記物dspp(dsp)和dmp1,證實細胞分化為具有分泌功能的成牙本質(zhì)細胞樣細胞。p_(75)~+emscs的成牙本質(zhì)細胞標(biāo)記物dspp和dmp1的mrna顯著高于p75-emscs。體內(nèi)在牙源性上皮干細胞的誘導(dǎo)下,p_(75)~+emscs呈一定層次圍繞島型牙源性上皮,強烈表達dsp和dmp1,而p75體外、體內(nèi)兩種成牙誘導(dǎo)模式下證實,p75p75-emscs;4.對比p75≥1.5),kegg代謝通路分析顯示涉及多個信號通路,其中tgf-β信號通路與牙齒發(fā)育密切相關(guān)。在差異基因中,smad4是tgf-β信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點。westernblot和Real-time PCR的結(jié)果也證實P_(75)~+EMSCs的Smad4表達水平顯著高于P75-EMSCs。P_(75)~+EMSCs經(jīng)特異性的si RNA-Smad4沉默后,其成牙能力相應(yīng)受到抑制,而P75-EMSCs經(jīng)smad4激活劑激活后,其成牙能力顯著增加。這一結(jié)果表明,P_(75)~+EMSCs較P75-EMSCs具有更為活躍的成牙分化潛能的機制,可能在于其通過smad4介導(dǎo)的TGF-β信號通路實現(xiàn)。結(jié)論:綜上所述,E11.5d大鼠胚胎腮弓來源的P_(75)~+EMSCs作為明確的神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細胞,對比非神經(jīng)嵴來源的P75-EMSCs,在體外和體內(nèi)兩種成牙誘導(dǎo)模式下都顯示更為活躍的牙向分化潛能。這一能力可能是通過Smad4為核心的TGF-β/Smad4信號通路介導(dǎo)獲得的。P_(75)~+EMSCs有希望作為一種新的干細胞資源,為研究完善牙發(fā)育理論,以及牙組織工程和牙再生醫(yī)學(xué)提供幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781

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本文編號：1696592