本文選題：TRAF2　切入點：口腔鱗癌　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。對于口腔鱗癌的治療,目前主要以外科手術(shù)為主,協(xié)同放化療或生物治療的綜合治療。雖綜合治療已取得了一定效果,但對于中晚期口腔鱗癌患者,療效仍不理想,總體生存率并無顯著提高。相對于放、化療等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段,靶向治療具有特異性強(qiáng)、用藥量低、毒副作用小、人體耐受性好等優(yōu)點。近年來,已有多種靶向治療應(yīng)用于臨床,并取得良好效果。但由于腫瘤細(xì)胞生長受多種途徑調(diào)控的特性,針對單一途徑的靶向治療長期預(yù)后受限,腫瘤易復(fù)發(fā),因此,發(fā)現(xiàn)新的靶向于腫瘤組織或者細(xì)胞的分子,尤其是參與多條信號通路的關(guān)鍵分子,在腫瘤治療和早期診斷上有非常重要的臨床意義。腫瘤壞死受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor2, TRAF2)是一類重要的胞漿銜接蛋白,它在多種惡性腫瘤細(xì)胞存在著高表達(dá),也是該家族中唯一的介導(dǎo)多條凋亡保護(hù)信號通路中的蛋白,是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)、外途徑凋亡的關(guān)鍵因子,但它在口腔頜面部惡性腫瘤,尤其口腔鱗癌中的特異性表達(dá)及其生物學(xué)功能尚未見文獻(xiàn)報道。本文第一部分研究TRAF2在口腔惡性腫瘤特別是鱗癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)間相關(guān)性的研究,第二部份探討了TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染(TRAF2基因沉默)對舌鱗癌細(xì)胞系CAL27生物學(xué)行為的影響,第三部分和第四部分研究了TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)合放射治療對體外培養(yǎng)的CAL27細(xì)胞及口腔鱗癌動物模型體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)行為的影響。本研究以口腔鱗癌臨床標(biāo)本、細(xì)胞系培養(yǎng)、動物模型等一系列實驗對象,系統(tǒng)地進(jìn)行了體內(nèi)、外實驗研究,擬確定TRAF2為口腔鱗癌靶向治療的關(guān)鍵位點,確定TRAF2基因沉默(TRAF2siRNA)可促進(jìn)放療增敏作用,從而為口腔鱗癌臨床治療提供一種新治療思路及其實驗依據(jù)。 方法： 1.通過免疫組織化學(xué)的方法檢測57例口腔惡性腫瘤組織標(biāo)本(50例鱗癌組織和7例其它惡性腫瘤)和30例癌旁2cm以上正常粘膜組織中TRAF2的表達(dá),采用免疫組織化學(xué)得分和平均光密度值來確定TRAF2在組織中的反應(yīng)強(qiáng)度,統(tǒng)計分析TRAF2表達(dá)與腫瘤大小、TNM臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。 2.將TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞系CAL27, Western Blot法鑒定siRNA轉(zhuǎn)染后的TRAF2蛋白表達(dá)下調(diào)(基因沉默)效果以及NF-κB信號通路中TRAF2下游蛋白RIP1表達(dá)的改變。通過CCK8細(xì)胞活力檢測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI雙染法)等方法檢測IJTRAF2siRNA轉(zhuǎn)染對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布等生物學(xué)行為的影響。 3.采用不同劑量(2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的x射線照射TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染、Control siRNA轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的舌鱗癌細(xì)胞系CAL27,通過CCK8細(xì)胞活力檢測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI雙染法,PI單染法)等方法驗證TRAF2siRNA對細(xì)胞放療增敏的效果,檢測不同放射劑量對TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染的CAL27細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響,并篩選出適宜的放射劑量用于更深入的動物體內(nèi)實驗。 4.采用懸液注射法建立CAL27舌癌裸鼠動物模型,通過EntransterTM-in vivo體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑將TRAF2siRNA直接轉(zhuǎn)染已建模的實體腫瘤,比較在6Gy放射劑量下TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和未經(jīng)放射組三組裸鼠腫瘤體積和瘤重的變化。 結(jié)果： 1.在50例口腔鱗癌組織中,TRAF2表達(dá)陽性46例,其陽性表達(dá)率為92%,其中26例表達(dá)弱陽性(占52%),20例表達(dá)陽性(占40%)。TRAF2在口腔其他惡性腫瘤中表達(dá)呈100%陽性,但在正�？谇徽衬そM織中低表達(dá)。本實驗數(shù)據(jù)表明TRAF2的表達(dá)程度與口腔癌的病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05),但尚不能證明TRAF2與腫瘤大小、TNM臨床分期的生物學(xué)行為有關(guān)(P0.05)。 2. TRAF2siRNA可有效轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞系CAL27,轉(zhuǎn)染后TRAF2蛋白表達(dá)明顯下降,并出現(xiàn)NF-κB途徑中相應(yīng)下游蛋白RIP的表達(dá)下降。通過對TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞活力和早期凋亡率的進(jìn)一步對比中發(fā)現(xiàn),TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性沒有明顯改變,但細(xì)胞早期凋亡率有一定增高(P0.05)。 3.比較不同放射劑量下]TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞的細(xì)胞活力、早期凋亡率和細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)在放射下,三組細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞活力和早期凋亡率的改變以及G2／M期阻滯作用,其中TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞改變最為明顯。當(dāng)放射劑量在6Gy時,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力下降和早期凋亡率升高以及G2／M期細(xì)胞比例增高最為最明顯,組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 4.成功建立CAL27舌癌裸鼠動物模型,比較未放射組、放射組、轉(zhuǎn)染TRAF2siRNA+放射組三組裸鼠腫瘤體積和腫瘤重量,結(jié)果顯示,放射組比未放射組裸鼠腫瘤體積和重量明顯減小,而TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染+放射組裸鼠腫瘤體積和重量減小更加明顯,腫瘤抑制率達(dá)到88.2%,較放射組提高了18.1%。 結(jié)論： 1. TRAF2在口腔鱗癌組織中呈特異性的高表達(dá),而在口腔正常組織低表達(dá)。 2. TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染可使CAL27舌鱗癌細(xì)胞TRAF2蛋白表達(dá)有效沉默(較congtrol組下降47%)。轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞增殖能力沒有明顯改變,但腫瘤細(xì)胞的凋亡率隨TRAF2的表達(dá)下降而升高。 3.在不同劑量的X射線放射下,TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染的CAL27細(xì)胞,出現(xiàn)G2/M期阻滯和G2/M期細(xì)胞比例的上調(diào),并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡率的增加和細(xì)胞增殖抑制,細(xì)胞活力曲線下降,具有明顯的放射增敏作用。 4. TRAF2siRNA可提高舌鱗癌裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的放射敏感性,與單純放療相比較,TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合放療可更有效地減小腫瘤體積和重量,提高腫瘤抑制率。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫國敬,錢俊杰,孟祥兵,宋宜,張楓,梅柱中,董燕,孫志賢;蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡前G_2/M期阻滯及機(jī)制[J];癌癥;2004年10期

2 劉淑春,呂U，

本文編號：1670992