本文選題：低強度脈沖超聲　切入點：人牙周膜細胞　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：牙周炎是一種慢性感染性疾病,累及牙齒及牙周組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨及牙骨質(zhì))。常規(guī)的牙周治療主要是通過手術或非手術的方法,徹底清除局部刺激因素,阻止牙周炎的發(fā)生發(fā)展,同時創(chuàng)造有利的牙周微環(huán)境以期牙周組織再生。低強度脈沖超聲(Low-Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS)作為一種安全無創(chuàng)的治療方式,有研究報道LIPUS輻照具有有效的抑制炎癥及促進成骨的作用。但其在牙周領域?qū)ρ乐苎装Y的抑制作用及促進炎癥環(huán)境下成骨的研究尚較缺乏。基于課題組前期研究,我們猜測LIPUS輻照可能通過抑制牙周炎癥微環(huán)境從而增強炎癥環(huán)境下人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells,h PDLCs)的成骨分化能力。本實驗建立在前期動物實驗已證實LIPUS輻照急性牙周缺損可增強組織新骨形成及文獻報道LIPUS對炎癥環(huán)境下成骨相關細胞的炎癥抑制作用的基礎上,通過牙齦普林單胞菌(P.gingivalis,Pg.)來源的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導h PDLCs模擬牙周炎癥微環(huán)境,并采用LIPUS對炎癥微環(huán)境下的h PDLCs進行輻照,以探究LIPUS在牙周炎癥微環(huán)境中的應用。Pg.LPS作為牙周炎最重要的致病因素和公認的炎癥啟動因子,可較好的模擬體外牙周炎癥微環(huán)境。LIPUS是以脈沖式、低強度超聲波的形式應用于體內(nèi)及體外研究,已被證實具有增強細胞增殖活性,促進細胞成骨分化、抑制炎癥因子分泌表達等作用。本實驗設計共分為以下五個部分:第一部分人牙周膜細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性鑒定目的:體外分離、培養(yǎng)h PDLCs,對細胞進行鑒定,為后續(xù)實驗奠定基礎。方法:采用組織塊法+酶消化法從前磨牙分離、培養(yǎng)原代h PDLCs并進行傳代培養(yǎng)。人波形絲蛋白(vimentin)、人角蛋白(CK14)染色鑒定細胞來源;流式細胞術檢測細胞表面標記物表達;成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)基體外誘導培養(yǎng)h PDLCs,第21天后檢測多向分化能力。結果:傳至第3代的h PDLCs形態(tài)均一,呈長梭形,為典型成纖維樣細胞。人波形絲蛋白(vimentin)染色陽性,人角蛋白(CK14)染色陰性。間充質(zhì)干細胞特異性表面抗原表達CD73:99.88%,CD146:71.6%,Strol-1:1.21%,CD34:0.62%。成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)基體外誘導培養(yǎng)h PDLCs第21天后,茜素紅S染色陽性,阿利新藍染色陽性,油紅O染色陽性。結論:本實驗成功培養(yǎng)出間充質(zhì)來源的h PDLCs,其中含有較多的間充質(zhì)干細胞成份,細胞增殖能力較強,具有多向分化潛能,可用于后續(xù)實驗研究。第二部分炎癥微環(huán)境下低強度脈沖超聲輻照對人牙周膜細胞表達IL-6、IL-8抑制作用的研究目的:研究LIPUS輻照LPS刺激的h PDLCs,檢測炎癥因子IL-6、IL-8的表達變化,篩選LIPUS的最適輻照參數(shù),探究LIPUS對炎癥因子IL-6、IL-8表達的抑制作用及其輻照的安全性。方法:1 ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模擬牙周炎癥微環(huán)境,選用10、30、60、90 m W/cm2四個LIPUS輻照強度分別對處理的細胞連續(xù)輻照2h,探究LIPUS對炎癥因子IL-6、IL-8表達的抑制作用并篩選LIPUS最適輻照參數(shù)。具體檢測方法包括:ELISA檢測IL-6、IL-8蛋白表達水平變化;q PCR檢測IL-6、IL-8基因表達水平變化;CCK-8檢測LIPUS輻照對細胞增殖活性影響;流式細胞術檢測LIPUS輻照對細胞凋亡影響。結果:ELISA和q PCR檢測結果表明30、60、90 m W/cm2LIPUS輻照對IL-6、IL-8的蛋白分泌及基因表達均具有明顯抑制作用(p0.05),且90m W/cm2LIPUS輻照強度對炎癥抑制作用最強,因此對90m W/cm2 LIPUS輻照強度的安全性進行后續(xù)研究。CCK-8檢測細胞增殖活性表明90m W/cm2LIPUS輻照不會導致細胞死亡且對細胞增殖具有一定促進作用(p0.05),流式細胞檢測證實90m W/cm2 LIPUS輻照對細胞的凋亡具有一定抑制作用(p0.05)。結論:LIPUS輻照能有效抑制炎癥因子IL-6、IL-8的分泌表達。90m W/cm2 LIPUS對IL-6、IL-8的抑制作用最明顯,且對細胞無有害作用,能增強細胞增殖活性、抑制細胞凋亡,因此,我們選用90m W/cm2強度作為LIPUS最適輻照強度。本部分實驗證實LIPUS可作為一種安全有效的輻照方式應用于探究LIPUS輻照對微環(huán)境下h PDLCs的炎癥因子分泌及成骨分化能力影響的后續(xù)研究中。第三部分炎癥微環(huán)境下低強度脈沖超聲輻照對人牙周膜細胞NF-κB炎癥信號通路的影響及機制研究目的:NF-κB信號通路作為與牙周炎關系最密切的信號通路,本部分實驗研究LIPUS輻照抑制LPS刺激模擬的牙周炎癥微環(huán)境下IL-6、IL-8表達與NF-κB信號通路相關的分子機制。方法:1ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模擬牙周炎癥微環(huán)境,選用90 m W/cm2 LIPUS輻照強度對處理的細胞連續(xù)輻照2h,Western Blot(WB)檢測NF-κB信號通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65變化;免疫熒光檢測NF-κB信號通路的p65入核情況。結果:WB檢測IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65結果提示LIPUS輻照有效抑制LPS刺激的h PDLCs的NF-κB信號通路;免疫熒光檢測NF-κB信號通路的p65入核情況表明LIPUS輻照后,p65入核較LPS組減少,說明LIPUS可通過抑制NF-κB信號通路從而抑制IL-6、IL-8表達。結論:在LPS模擬的炎癥微環(huán)境下,LIPUS輻照可有效抑制NF-κB炎癥信號通路,從而改善炎癥微環(huán)境。第四部分炎癥微環(huán)境下低強度脈沖超聲輻照對人牙周膜細胞成骨分化能力影響的研究目的:炎癥微環(huán)境下h PDLCs成骨分化能力下降,在成骨誘導條件下模擬炎癥微環(huán)境并予以LIPUS輻照,研究LIPUS輻照能否通過抑制炎癥因子的分泌提高h PDLCs的成骨分化能力。方法:1ug/ml LPS刺激成骨誘導條件下h PDLCs,90m W/cm2 LIPUS進行輻照,30min/天,連續(xù)輻照7天后對細胞進行相關檢測。具體檢測方法包括:q PCR檢測IL-6、IL-8基因表達水平及成骨相關基因RUNX2、OPN、OSX、OCN的表達水平;堿性磷酸酶染色及定量分析;CCK-8檢測細胞增殖活性。結果:LIPUS連續(xù)輻照7天后,q PCR檢測IL-6、IL-8的基因水平表明90m W/cm2LIPUS+LPS+OM組IL-6、IL-8基因表達水平比LPS+OM組降低(p0.01),表明LIPUS連續(xù)輻照可抑制IL-6、IL-8的表達;q PCR檢測成骨相關基RUNX2、OPN、OSX、OCN發(fā)現(xiàn)LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM組成骨相關基因的表達水平均較LPS+OM組增加(p0.05),表明LIPUS連續(xù)輻照能增強炎癥為環(huán)境下h PDLCs的成骨基因表達;堿性磷酸酶染色及定量分析結果顯示LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM組較LPS+OM組成骨分化能力更強(p0.05);CCK-8檢測細胞增殖活性表明LIPUS連續(xù)輻照對細胞增殖活性無有害影響。結論:LIPUS輻照LPS刺激的成骨誘導條件下h PDLCs發(fā)現(xiàn),LIPUS連續(xù)輻照可有效抑制炎癥因子IL-6、IL-8表達,同時增強h PDLCs在炎癥微環(huán)境下的成骨分化能力。第五部分炎癥微環(huán)境下低強度脈沖超聲輻照對人牙周膜細胞成骨分化能力影響與NF-κB炎癥信號通路的關系及機制研究目的:探究LIPUS抑制炎癥因子IL-6、IL-8表達從而增強h PDLCs在成骨誘導環(huán)境下的成骨分化能力與NF-κB信號通路的關系及其分子機制,并采用NF-κB信號通路抑制劑進一步證實。方法:WB檢測LIPUS輻照炎癥微環(huán)境下h PDLCs的NF-κB信號通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65蛋白變化。采用NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082抑制NF-κB信號通路后,90m W/cm2 LIPUS輻照炎癥微環(huán)境下h PDLCs,連續(xù)輻照(30min/天)7天后對細胞進行相關檢測。具體檢測包括:q PCR檢測成骨相關基因RUNX2、OPN、OSX、OCN基因表達水平;堿性磷酸酶染色及定量分析;WB檢測NF-κB信號通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65蛋白變化。結果:LIPUS輻照LPS刺激下成骨誘導的h PDLCs,WB結果顯示LIPUS連續(xù)輻照能有效抑制NF-κB信號通路。分別加入BAY 11-7082抑制劑或予以LIPUS輻照后,q PCR結果表明RUNX2、OPN、OSX、OCN的基因表達水平較LPS組增強(p0.05)。堿性磷酸酶染色及定量分析結果顯示也證明BAY11-7082抑制NF-κB信號通路及LIPUS連續(xù)輻照h PDLCs的成骨分化能力較LPS組更強(p0.05)。WB結果證實LIPUS起著類似BAY11-7082劑的作用有效抑制NF-κB信號通路。結論:LIPUS連續(xù)輻照能夠有效抑制NF-κB信號通路。使用抑制劑BAY-11-7082阻斷NF-κB信號通路發(fā)現(xiàn),抑制NF-κB信號通路可促進炎癥微環(huán)境下h PDLCs的成骨分化能力,說明NF-κB信號通路參與調(diào)控炎癥環(huán)境下h PDLCs的成骨分化,且通過抑制NF-κB信號通路可增強h PDLCs的成骨分化能力。本部分研究證實LIPUS輻照通過抑制炎癥微環(huán)境中的NF-κB信號通路提高炎癥環(huán)境下h PDLCs的成骨能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：1666245