發(fā)布時(shí)間：2018-03-26 04:03

  本文選題：低強(qiáng)度脈沖超聲　切入點(diǎn)：人牙周膜細(xì)胞　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：牙周炎是一種慢性感染性疾病,累及牙齒及牙周組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨及牙骨質(zhì))。常規(guī)的牙周治療主要是通過(guò)手術(shù)或非手術(shù)的方法,徹底清除局部刺激因素,阻止牙周炎的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)創(chuàng)造有利的牙周微環(huán)境以期牙周組織再生。低強(qiáng)度脈沖超聲(Low-Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS)作為一種安全無(wú)創(chuàng)的治療方式,有研究報(bào)道LIPUS輻照具有有效的抑制炎癥及促進(jìn)成骨的作用。但其在牙周領(lǐng)域?qū)ρ乐苎装Y的抑制作用及促進(jìn)炎癥環(huán)境下成骨的研究尚較缺乏�；谡n題組前期研究,我們猜測(cè)LIPUS輻照可能通過(guò)抑制牙周炎癥微環(huán)境從而增強(qiáng)炎癥環(huán)境下人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,h PDLCs)的成骨分化能力。本實(shí)驗(yàn)建立在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)LIPUS輻照急性牙周缺損可增強(qiáng)組織新骨形成及文獻(xiàn)報(bào)道LIPUS對(duì)炎癥環(huán)境下成骨相關(guān)細(xì)胞的炎癥抑制作用的基礎(chǔ)上,通過(guò)牙齦普林單胞菌(P.gingivalis,Pg.)來(lái)源的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)h PDLCs模擬牙周炎癥微環(huán)境,并采用LIPUS對(duì)炎癥微環(huán)境下的h PDLCs進(jìn)行輻照,以探究LIPUS在牙周炎癥微環(huán)境中的應(yīng)用。Pg.LPS作為牙周炎最重要的致病因素和公認(rèn)的炎癥啟動(dòng)因子,可較好的模擬體外牙周炎癥微環(huán)境。LIPUS是以脈沖式、低強(qiáng)度超聲波的形式應(yīng)用于體內(nèi)及體外研究,已被證實(shí)具有增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞成骨分化、抑制炎癥因子分泌表達(dá)等作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為以下五個(gè)部分:第一部分人牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定目的:體外分離、培養(yǎng)h PDLCs,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法:采用組織塊法+酶消化法從前磨牙分離、培養(yǎng)原代h PDLCs并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。人波形絲蛋白(vimentin)、人角蛋白(CK14)染色鑒定細(xì)胞來(lái)源;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá);成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)h PDLCs,第21天后檢測(cè)多向分化能力。結(jié)果:傳至第3代的h PDLCs形態(tài)均一,呈長(zhǎng)梭形,為典型成纖維樣細(xì)胞。人波形絲蛋白(vimentin)染色陽(yáng)性,人角蛋白(CK14)染色陰性。間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原表達(dá)CD73:99.88%,CD146:71.6%,Strol-1:1.21%,CD34:0.62%。成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)h PDLCs第21天后,茜素紅S染色陽(yáng)性,阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性,油紅O染色陽(yáng)性。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)出間充質(zhì)來(lái)源的h PDLCs,其中含有較多的間充質(zhì)干細(xì)胞成份,細(xì)胞增殖能力較強(qiáng),具有多向分化潛能,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。第二部分炎癥微環(huán)境下低強(qiáng)度脈沖超聲輻照對(duì)人牙周膜細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8抑制作用的研究目的:研究LIPUS輻照LPS刺激的h PDLCs,檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-8的表達(dá)變化,篩選LIPUS的最適輻照參數(shù),探究LIPUS對(duì)炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)的抑制作用及其輻照的安全性。方法:1 ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模擬牙周炎癥微環(huán)境,選用10、30、60、90 m W/cm2四個(gè)LIPUS輻照強(qiáng)度分別對(duì)處理的細(xì)胞連續(xù)輻照2h,探究LIPUS對(duì)炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)的抑制作用并篩選LIPUS最適輻照參數(shù)。具體檢測(cè)方法包括:ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8蛋白表達(dá)水平變化;q PCR檢測(cè)IL-6、IL-8基因表達(dá)水平變化;CCK-8檢測(cè)LIPUS輻照對(duì)細(xì)胞增殖活性影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LIPUS輻照對(duì)細(xì)胞凋亡影響。結(jié)果:ELISA和q PCR檢測(cè)結(jié)果表明30、60、90 m W/cm2LIPUS輻照對(duì)IL-6、IL-8的蛋白分泌及基因表達(dá)均具有明顯抑制作用(p0.05),且90m W/cm2LIPUS輻照強(qiáng)度對(duì)炎癥抑制作用最強(qiáng),因此對(duì)90m W/cm2 LIPUS輻照強(qiáng)度的安全性進(jìn)行后續(xù)研究。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性表明90m W/cm2LIPUS輻照不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡且對(duì)細(xì)胞增殖具有一定促進(jìn)作用(p0.05),流式細(xì)胞檢測(cè)證實(shí)90m W/cm2 LIPUS輻照對(duì)細(xì)胞的凋亡具有一定抑制作用(p0.05)。結(jié)論:LIPUS輻照能有效抑制炎癥因子IL-6、IL-8的分泌表達(dá)。90m W/cm2 LIPUS對(duì)IL-6、IL-8的抑制作用最明顯,且對(duì)細(xì)胞無(wú)有害作用,能增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性、抑制細(xì)胞凋亡,因此,我們選用90m W/cm2強(qiáng)度作為L(zhǎng)IPUS最適輻照強(qiáng)度。本部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)LIPUS可作為一種安全有效的輻照方式應(yīng)用于探究LIPUS輻照對(duì)微環(huán)境下h PDLCs的炎癥因子分泌及成骨分化能力影響的后續(xù)研究中。第三部分炎癥微環(huán)境下低強(qiáng)度脈沖超聲輻照對(duì)人牙周膜細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響及機(jī)制研究目的:NF-κB信號(hào)通路作為與牙周炎關(guān)系最密切的信號(hào)通路,本部分實(shí)驗(yàn)研究LIPUS輻照抑制LPS刺激模擬的牙周炎癥微環(huán)境下IL-6、IL-8表達(dá)與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的分子機(jī)制。方法:1ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模擬牙周炎癥微環(huán)境,選用90 m W/cm2 LIPUS輻照強(qiáng)度對(duì)處理的細(xì)胞連續(xù)輻照2h,Western Blot(WB)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65變化;免疫熒光檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的p65入核情況。結(jié)果:WB檢測(cè)IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65結(jié)果提示LIPUS輻照有效抑制LPS刺激的h PDLCs的NF-κB信號(hào)通路;免疫熒光檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的p65入核情況表明LIPUS輻照后,p65入核較LPS組減少,說(shuō)明LIPUS可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而抑制IL-6、IL-8表達(dá)。結(jié)論:在LPS模擬的炎癥微環(huán)境下,LIPUS輻照可有效抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路,從而改善炎癥微環(huán)境。第四部分炎癥微環(huán)境下低強(qiáng)度脈沖超聲輻照對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨分化能力影響的研究目的:炎癥微環(huán)境下h PDLCs成骨分化能力下降,在成骨誘導(dǎo)條件下模擬炎癥微環(huán)境并予以LIPUS輻照,研究LIPUS輻照能否通過(guò)抑制炎癥因子的分泌提高h(yuǎn) PDLCs的成骨分化能力。方法:1ug/ml LPS刺激成骨誘導(dǎo)條件下h PDLCs,90m W/cm2 LIPUS進(jìn)行輻照,30min/天,連續(xù)輻照7天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。具體檢測(cè)方法包括:q PCR檢測(cè)IL-6、IL-8基因表達(dá)水平及成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、OSX、OCN的表達(dá)水平;堿性磷酸酶染色及定量分析;CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果:LIPUS連續(xù)輻照7天后,q PCR檢測(cè)IL-6、IL-8的基因水平表明90m W/cm2LIPUS+LPS+OM組IL-6、IL-8基因表達(dá)水平比LPS+OM組降低(p0.01),表明LIPUS連續(xù)輻照可抑制IL-6、IL-8的表達(dá);q PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基RUNX2、OPN、OSX、OCN發(fā)現(xiàn)LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM組成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平均較LPS+OM組增加(p0.05),表明LIPUS連續(xù)輻照能增強(qiáng)炎癥為環(huán)境下h PDLCs的成骨基因表達(dá);堿性磷酸酶染色及定量分析結(jié)果顯示LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM組較LPS+OM組成骨分化能力更強(qiáng)(p0.05);CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性表明LIPUS連續(xù)輻照對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)有害影響。結(jié)論:LIPUS輻照LPS刺激的成骨誘導(dǎo)條件下h PDLCs發(fā)現(xiàn),LIPUS連續(xù)輻照可有效抑制炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)h PDLCs在炎癥微環(huán)境下的成骨分化能力。第五部分炎癥微環(huán)境下低強(qiáng)度脈沖超聲輻照對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨分化能力影響與NF-κB炎癥信號(hào)通路的關(guān)系及機(jī)制研究目的:探究LIPUS抑制炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)從而增強(qiáng)h PDLCs在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下的成骨分化能力與NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系及其分子機(jī)制,并采用NF-κB信號(hào)通路抑制劑進(jìn)一步證實(shí)。方法:WB檢測(cè)LIPUS輻照炎癥微環(huán)境下h PDLCs的NF-κB信號(hào)通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65蛋白變化。采用NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082抑制NF-κB信號(hào)通路后,90m W/cm2 LIPUS輻照炎癥微環(huán)境下h PDLCs,連續(xù)輻照(30min/天)7天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。具體檢測(cè)包括:q PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、OSX、OCN基因表達(dá)水平;堿性磷酸酶染色及定量分析;WB檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路IκBα、p-IκBα、胞漿胞核p65蛋白變化。結(jié)果:LIPUS輻照LPS刺激下成骨誘導(dǎo)的h PDLCs,WB結(jié)果顯示LIPUS連續(xù)輻照能有效抑制NF-κB信號(hào)通路。分別加入BAY 11-7082抑制劑或予以LIPUS輻照后,q PCR結(jié)果表明RUNX2、OPN、OSX、OCN的基因表達(dá)水平較LPS組增強(qiáng)(p0.05)。堿性磷酸酶染色及定量分析結(jié)果顯示也證明BAY11-7082抑制NF-κB信號(hào)通路及LIPUS連續(xù)輻照h PDLCs的成骨分化能力較LPS組更強(qiáng)(p0.05)。WB結(jié)果證實(shí)LIPUS起著類似BAY11-7082劑的作用有效抑制NF-κB信號(hào)通路。結(jié)論:LIPUS連續(xù)輻照能夠有效抑制NF-κB信號(hào)通路。使用抑制劑BAY-11-7082阻斷NF-κB信號(hào)通路發(fā)現(xiàn),抑制NF-κB信號(hào)通路可促進(jìn)炎癥微環(huán)境下h PDLCs的成骨分化能力,說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥環(huán)境下h PDLCs的成骨分化,且通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路可增強(qiáng)h PDLCs的成骨分化能力。本部分研究證實(shí)LIPUS輻照通過(guò)抑制炎癥微環(huán)境中的NF-κB信號(hào)通路提高炎癥環(huán)境下h PDLCs的成骨能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：1666245