本文選題：B型原花青素低聚體　切入點(diǎn)：遠(yuǎn)緣鏈球菌6715　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：齲齒是一種由細(xì)菌感染引起的疾病,嚴(yán)重危害人們的口腔健康。致齲菌通過(guò)粘附聚集在牙齒表面,形成牙菌斑,再利用蔗糖產(chǎn)酸,造成牙齒脫礦,導(dǎo)致齲齒的發(fā)生。若能抑制致齲菌的粘附聚集,就能從根本上防止齲齒的發(fā)生。原花青素是一種從植物中分離得到的天然活性多酚,在天然抗齲齒功效成分的研究中越來(lái)越受到關(guān)注,但原花青素對(duì)S.sobrinus致齲作用的抑制效果和抑制機(jī)理尚不清楚。本文從高粱外種皮中分離得到3種B型原花青素低聚體(sorghum episperm procyanidin,SEP),以S.sobrinus ATCC 6715為對(duì)象,比較SEP對(duì)S.sobrinus ATCC 6715生長(zhǎng)的抑制和初始粘附的干預(yù)效果,篩選出高抗齲活性的SEP。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)基因克隆重組表達(dá)的方法得到S.sobrinus ATCC 6715的GTF-I的CAT區(qū)蛋白,并通過(guò)光譜法研究SEPⅣ與GTF-I的CAT區(qū)蛋白的相互作用,探討SEPⅣ對(duì)GTF-I活性的抑制機(jī)理,期望為揭示SEPⅣ抗齲齒的作用機(jī)制提供依據(jù)。本文研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下:1.高粱外種皮中B型低聚體的提取分離和鑒定:采用70%的乙醇提取SEP,通過(guò)AB-8大孔樹脂純化得到原花青素混合物,并用乙酸乙酯萃取得到原花青素低聚體,再通過(guò)Toyopearl HW-40s凝膠色譜分離得到三組目標(biāo)級(jí)分,經(jīng)過(guò)RP-HPLC-ESI-MS/MS鑒定,三組級(jí)分對(duì)應(yīng)的分子離子m/z分別為577、865和1153,分別為B型原花青素二聚體、三聚體和四聚體,將三組級(jí)分分別命名為SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ。2.SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ對(duì)S.sobrinus ATCC 6715生長(zhǎng)和初始粘附的影響:通過(guò)二倍稀釋法研究SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ對(duì)S.sobrinus ATCC 6715的MIC值分別為16.00 mg/m L、16.00 mg/m L和8.00 mg/m L,證明SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ都可以抑制S.sobrinus ATCC 6715的生長(zhǎng)。采用唾液包被的羥基磷灰石(saliva coated hydroxylapatite,SHA)體外模型模擬牙齒表面,用SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ分別處理唾液、唾液獲得性膜和S.sobrinus ATCC 6715菌體三種途徑干預(yù)S.sobrinus ATCC6715在SHA上的初始粘附過(guò)程,SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ處理唾液干預(yù)S.sobrinus ATCC 6715在SHA的粘附抑制率分別為10%-42%、30%-42%和20%-45%;SEPⅡ、sepⅢ和sepⅣ處理唾液獲得性膜干預(yù)s.sobrinusatcc6715在sha的粘附抑制率分別為7%-35%、10%-47%和20%-54%;sepⅡ、sepⅢ和sepⅣ處理s.sobrinusatcc6715菌體表面干預(yù)其在sha的粘附抑制率分別為33%-63%、42%-66%和50%-75%,結(jié)果表明,sepⅡ、sepⅢ和sepⅣ都可以抑制s.sobrinusatcc6715在sha上的初始粘附,抑制效果都隨著濃度的增大而增大,具有一定的濃度效應(yīng)關(guān)系;且對(duì)初始粘附抑制效果的強(qiáng)弱順序是:sepⅣsepⅢsepⅡ,sepⅣ是具有高抗齲活性的物質(zhì)。在處理唾液、唾液獲得性膜和s.sobrinusatcc6715菌體3種干預(yù)途徑中,作用于菌比作用于唾液和唾液獲得性膜的抑制效果更好,說(shuō)明sep對(duì)菌的抑制是干預(yù)s.sobrinusatcc6715在牙齒表面初始粘附的主要途徑。3.s.sobrinusatcc6715中g(shù)tf-i的cat區(qū)蛋白的克隆、表達(dá)和鑒定:為了進(jìn)一步研究sepⅣ對(duì)促進(jìn)s.sobrinusatcc6715粘附聚集的gtf-i的抑制效果和作用機(jī)制,通過(guò)基因工程重組表達(dá)的方法獲得s.sobrinusatcc6715中g(shù)tf-i的cat區(qū)蛋白。通過(guò)pcr擴(kuò)增cat的基因片段到質(zhì)粒pgex-4t-1中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌t7expresscompetente.coli(highefficiency)表達(dá),1mmol/liptg,37℃誘導(dǎo)4h,純化、濃縮得到目標(biāo)蛋白gtf-i/cat,純度為85%,表達(dá)量為1.22mg/ml,nanolc-ms/ms鑒定結(jié)果表明gtf-i/cat蛋白是來(lái)源于s.sobrinusatcc6715(血清型g)的gtf-i,得分為103.75,鑒定結(jié)果可信;neson-somogyi法測(cè)得其酶活為8.446miu,蒽酮硫酸法測(cè)得其產(chǎn)多糖能力為1.603mg/(mg·h)。4.sepⅣ與gtf-i/cat相互作用的研究:用不同濃度sepⅣ處理gtf-i/cat,根據(jù)wic生成量評(píng)價(jià)sepⅣ對(duì)gtf-i/cat活力的影響,sep-Ⅳ可以抑制gtf-i/cat產(chǎn)wig,抑制效果隨著sep-Ⅳ濃度的增大而增大,當(dāng)sep-Ⅳ的濃度大于125μg/ml,能使wig產(chǎn)量顯著性降低(p0.01)。通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光淬滅光譜和同步熒光光譜研究sepⅣ與gtf-i/cat的相互作用,熒光光譜分析結(jié)果表明,sep-Ⅳ可以對(duì)gtf-i/cat產(chǎn)生熒光淬滅,stem-volmer方程分析淬滅機(jī)制是靜態(tài)淬滅;兩者發(fā)生結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.7682(289k)、0.7924(299k)和0.8617(309k),約等于1;熱力學(xué)參數(shù)△g0、△s0、△h0,說(shuō)明sep-Ⅳ和gtf-i/cat之間主要是通過(guò)疏水作用力結(jié)合;同步熒光表明,sep-Ⅳ與gtf-i/cat的結(jié)合位點(diǎn)更靠近色氨酸殘基。sep-Ⅳ可以使gtf-i/cat的紫外-可見(jiàn)吸收光譜的吸收峰的吸光值增加并發(fā)生紅移,說(shuō)明SEP-Ⅳ可以對(duì)GTF-I/CAT蛋白構(gòu)象產(chǎn)生影響,并進(jìn)一步證明SEP-Ⅳ和GTF-I/CAT之間是靜態(tài)淬滅。結(jié)果表明,SEPⅣ與GTF-I的CAT的相互作用,可以改變CAT的構(gòu)象,對(duì)酶的功能和活性產(chǎn)生影響,導(dǎo)致WIG產(chǎn)量降低,從而減少致齲菌在牙齒表面的粘附聚集,預(yù)防齲齒的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.1

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