本文選題：促性腺激素釋放激素受體　切入點：曲普瑞林　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:目前已知有多種癌細胞表面存在I型促性腺激素釋放激素受體(Gn RHR-I),但國內(nèi)外尚未見有關于口腔癌細胞或組織表達Gn RHR-I的報道,并且多數(shù)學者認為腫瘤細胞表面Gn RHR-I與其在下丘腦-垂體-性腺軸的細胞內(nèi)所介導的信號轉導機制不同。因此本研究選取口腔癌KB細胞株,驗證其Gn RHR-I基因及蛋白的表達,并通過細胞增殖抑制實驗、Real-Time PCR、Western Blot、i TRAQ等實驗方法希望解釋體內(nèi)激素水平影響腫瘤組織的生長狀態(tài)及找到口腔癌細胞表面Gn RHR-I的存在意義。方法:1.RT-RCR方法及電泳后切膠回收測序方法基因水平驗證KB細胞存在Gn RHR-I m RNA表達,Western Blot方法蛋白水平證實KB細胞存在Gn RHR-I蛋白表達。2.利用CCK-8試劑盒檢測不同濃度(10、20、40、80μg/ml)Gn RH-I及Triptorelin處理KB細胞48小時后450 nm處吸光值并計算存活率。3.熒光定量PCR方法對CAL-27、SCC-4、KB三株口腔癌細胞Gn RHR m RNA表達水平進行相對鑒定。4.熒光定量PCR方法檢測Gn RH-I及Triptorelin處理KB細胞48小時對細胞Gn RHR-I表達水平的影響,檢測Triptorelin處理KB細胞12、24、36、48小時對細胞Gn RHR-I m RNA表達水平的影響。5.同位素標記相對和絕對定量(i TRAQ)方法解析Triptorelin處理KB細胞48小時后與對照組相比較的差異蛋白表達譜,并做GO、KEGG分析獲得代謝通路變化情況。結果:1.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并進行切膠回收測序檢測顯示KB細胞Gn RHR-I基因擴增結果正確。Western Blot結果顯示,KB細胞蛋白在60k Da處存在Gn RHR-I特異性反應條帶。2.Gn RH-I處理KB細胞48小時后酶標儀檢測450nm處吸光值,對照組、10、20、40、80μg/ml處理組吸光值分別為1.475±0.017、1.455±0.013、1.437±0.017、1.418±0.016、1.392±0.019,存活率分別為100.00±0.013%、98.537±0.009%、97.186±0.012%、95.784±0.012%、93.860±0.014%。10μg/ml Gn RH處理KB細胞48小時與對照組相比,細胞存活率無統(tǒng)計學差異(p=0.171),20μg/ml組與對照組相比存活率有顯著差異(p=0.018),40、80μg/ml處理組與對照組相比存活率差異有極顯著性(p=0.002,p=0.0001)。Triptorelin處理KB細胞48小時對照組、10、20、40、80μg/ml組吸光值分別為1.475±0.017,1.444±0.019,1.429±0.023,1.401±0.018,1.332±0.032。細胞存活率分別為100.00±0.013%,97.701±0.014%,96.431±0.017%,94.507±0.013%,89.485±0.024%。10μg/ml Triptorelin處理KB細胞48小時與對照組相比,存活率無統(tǒng)計學差異(p=0.118),20μg/ml Triptorelin組與對照組相比存活率有顯著差異(p=0.022),40、80μg/ml Triptorelin處理組與對照組相比存活率差異有極顯著性(p=0.002,p=0.0001)。相同濃度組間比較顯示,Gn RH-I與曲普瑞林對KB細胞增殖抑制能力均無差異(p0.05)。3.對三株口腔癌細胞CAL-27、SCC-4、KB的相對定量分析顯示,KB細胞Gn RHR-I m RNA表達量為SCC-4的1.810±0.049倍(p0.01),人舌鱗癌細胞株CAL-27的Gn RHR-I表達水平在三種細胞中最高,為SCC-4的3.564±0.066倍(p0.0001)。4.熒光定量PCR結果顯示,Gn RH-I處理KB細胞48小時后Gn RHR-I m RNA表達量為對照組的0.256±0.023倍(p0.01),Triptorelin處理組m RNA表達量為對照組的0.117±0.013倍(p0.01),Triptorelin顯示對KB細胞Gn RHR-I m RNA的表達有更強的抑制能力(p0.01)。Triptorelin處理KB細胞12、24、36、48小時的m RNA表達水平分別為對照組的0.926±0.021倍(p=0.186)、0.565±0.016倍(p0.01)、0.250±0.022倍(p0.01)、0.175±0.034倍(p0.0001),24、36、48小時組與對照組相比較差異具極顯著意義(p0.01)。5.基于i TRAQ技術的曲普瑞林對KB細胞抑制作用的蛋白組學分析顯示KB細胞差異蛋白數(shù)共58個點,上調(diào)14個,下調(diào)44個(p0.05)。差異蛋白經(jīng)GO與KEGG分析主要與蛋白酶體下調(diào)有關(p0.01)。結論:1.口腔癌KB細胞株促性腺激素釋放激素受體基因及蛋白檢測呈陽性。2.Gn RH-I和Triptorelin能夠抑制KB細胞增殖。隨Gn RH-I和Triptorelin濃度增加,細胞存活率逐漸降低,相同濃度的Gn RH-I和Triptorelin對細胞的增殖抑制能力無差異。3.人舌鱗狀細胞癌細胞株CAL-27在SCC-4、CAL-27、KB三株口腔癌細胞中Gn RHR-I m RNA表達量最高,SCC-4最低。4.Gn RH-I和Triptorelin均能夠下調(diào)KB細胞的Gn RHR-I m RNA表達水平,其中Triptorelin顯示更強的下調(diào)KB細胞Gn RHR-I m RNA能力。Triptorelin下調(diào)KB細胞Gn RHR-I m RNA表達具有時間依賴性。5.曲普瑞林對KB細胞的增殖抑制作用機制為對蛋白酶體亞單位等關鍵蛋白下調(diào),干擾細胞內(nèi)蛋白降解,從而抑制細胞增殖,顯示曲普瑞林作為一種蛋白酶體抑制劑抑制細胞增殖。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.8

【參考文獻】

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1 李健;魏洪濤;張國利;岳玉環(huán);吳廣謀;田園;邱麗娜;馬洪圓;王冬冬;吉元剛;;舌癌CAL-27細胞GnRHR的檢測及曲普瑞林對細胞增殖抑制作用研究[J];中國實驗診斷學;2017年03期

2 李明;繆澤鴻;丁健;;蛋白酶體及其抑制劑的研究進展[J];中國藥理學通報;2008年05期

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本文編號：1631133