本文選題：牙周膜成纖維細胞　切入點：IL-17　出處：《武漢大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：牙周膜成纖維細胞是牙周膜的主要細胞類型,它在牙周組織的再生、完整性維持和功能實施過程中發(fā)揮重要作用。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是目前發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞新亞群Th17及其它免疫細胞分泌的一種獨特性細胞因子,能夠刺激成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞等產(chǎn)生多種效應(yīng)分子發(fā)揮廣泛的生物學作用。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-17能通過誘導(dǎo)多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)表達從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫與組織改建過程。 MMPs是降解牙周支持組織中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的重要酶類之一,它與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)相互作用,協(xié)調(diào)ECM降解與重建,維持牙周組織結(jié)構(gòu)的完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,其中MMP-1在細胞遷移和胞外基質(zhì)的病理修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,細胞遷移過程還涉及一系列細胞骨架調(diào)控蛋白的合成及重組。但目前IL-17對MMP-1調(diào)節(jié)方式及其參與調(diào)節(jié)細胞遷移的分子機制尚未完全明確,,我們推測IL-17可能通過調(diào)控牙周膜成纖維細胞表達MMP-1參與牙周組織改建過程。 本課題擬通過體外實驗探討IL-17介導(dǎo)牙周膜細胞表達MMPs及調(diào)節(jié)細胞遷移的作用方式,并觀察人及大鼠根尖周病損中IL-17及MMP-1的相互關(guān)系,分析兩者在根尖周炎病理過程中的作用。 第一部分：IL-17調(diào)控人牙周膜成纖維細胞表達MMPs及依賴的信號通路研究 實驗一：IL-17調(diào)控人牙周膜成纖維細胞表達MMPs研究 目的：初步探討IL-17對人牙周膜成纖維細胞表達MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的調(diào)節(jié)作用。 方法：體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞,RT-PCR、實時定量RT-PCR、ELISA和明膠酶譜法檢測牙周膜成纖維細胞受到IL-17刺激后MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的mRNA和蛋白表達水平。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞經(jīng)鑒定證實為中胚層來源。IL-17刺激牙周膜細胞后能顯著上調(diào)MMP-1和MMP-13的mRNA表達及蛋白分泌水平,同時下調(diào)MMP-2、MMP-9和TIMP-1的nRNA表達和蛋白分泌水平。不過,IL-17對EMMPRIN的mRNA表達及蛋白分泌水平無調(diào)控作用。 結(jié)論：IL-17能調(diào)控人牙周膜細胞差異性表達MMPs和TIMP-1,推測這一現(xiàn)象可能參與牙周炎癥及組織改建過程。 實驗二：IL-17調(diào)控人牙周膜成纖維細胞表達MMP-1及所依賴的信號通路研究 目的：觀察IL-17調(diào)控人牙周膜細胞表達MMP-1的作用機制,探討其所依賴的信號通路。 方法：體外培養(yǎng)人牙周膜細胞,實時定量RT-PCR、ELISA和Western blotting觀察IL-17刺激后MMP-1的mRNA和蛋白活性的表達水平；細胞免疫熒光染色定位人牙周膜細胞表達MMP-1的情況；Western blot檢測IL-17激活的信號通路情況；采用信號通路抑制劑和RNA沉默技術(shù)篩選參與IL-17介導(dǎo)MMP-1表達上調(diào)的信號通路分子；凝膠電泳遷移率實驗檢測轉(zhuǎn)錄蛋白和目的基因的相互作用。 結(jié)果：IL-17刺激牙周膜細胞上調(diào)MMP-1的mRNA和蛋白表達水平呈時間-濃度依賴性,且MMP-1前體和活性成分的表達強度均升高。IL-17受體的中和抗體可阻斷IL-17介導(dǎo)的MMP-1高表達。IL-17刺激牙周膜細胞后,p38-MAPK、 ERK1/2、JNK及Akt等信號激酶發(fā)生磷酸化,胞內(nèi)NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位。在IL-17刺激牙周膜細胞前用各種信號通路抑制劑預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)p38-MAPK抑制劑(SB203580)和NF-κB抑制劑(PDTC)預(yù)處理后MMP-1的表達水平降低。細胞轉(zhuǎn)染p38α siRNA能抑制IL-17介導(dǎo)的MMP-1高表達。此外,p38α siRNA還能抑制IL-17誘導(dǎo)后的NF-κB轉(zhuǎn)核及與目的基因的結(jié)合力。 結(jié)論：IL-17誘導(dǎo)牙周膜細胞表達MMP-1依賴IL-17與IL-17R的相互作用,及p38-MAPK/NF-κB信號通路。 第二部分：IL-17調(diào)節(jié)人牙周膜細胞遷移及其作用方式的研究 實驗三：IL-17調(diào)節(jié)人牙周膜細胞遷移及其作用方式的研究 目的：觀察IL-17對牙周膜細胞增值及遷移的影響,檢測IL-17調(diào)節(jié)牙周膜細胞內(nèi)骨架的改變,探討影響牙周膜細胞遷移的信號通路。 方法：體外培養(yǎng)人牙周膜細胞,CKK-8和劃痕實驗分別檢測IL-17誘導(dǎo)牙周膜細胞的增值和遷移情況；加入IL-17受體的中和抗體、TIMP-1、轉(zhuǎn)染MMP-1siRNA或p38α siRNA檢測IL-17介導(dǎo)細胞遷移的變化；細胞染色定位IL-17刺激前后細胞內(nèi)纖維狀肌動蛋白(F-actin)形成和胞內(nèi)骨架變化；免疫熒光雙染共定位磷酸化paxillin和F-actin的位置及分布；Western blotting檢測IL-17激活的粘附斑激酶(FAK)磷酸化情況。 結(jié)果：IL-17刺激能促進牙周膜細胞遷移但對細胞增值無影響。加入IL-17受體的中和抗體、TIMP-1、轉(zhuǎn)染MMP-1siRNA或p38α siRNA均能抑制IL-17介導(dǎo)下的細胞遷移。IL-17能促進細胞內(nèi)骨架改建,包括F-actin骨架重排、肌應(yīng)力纖維束形成及板狀偽足伸出,這一過程能被MMP-1siRNA和p38抑制劑所阻斷。 此外,IL-17還能促進細胞磷酸化paxillin向細胞膜和肌動蛋白細絲頂端移動聚集 以及激活粘附斑激酶(FAK)磷酸化。當加入p38抑制劑后IL-17介導(dǎo)下的細胞 內(nèi)骨架改建和磷酸化paxillin組裝受到抑制。 結(jié)論：IL-17促進牙周膜細胞遷移依賴p38-MAPK活化的MMP-1高表達,遷移 過程中IL-17介導(dǎo)的細胞骨架和粘附斑重組需要MMP-1的參與；FAK磷酸化和 p38-MAPK共同調(diào)節(jié)黏著斑的分布組裝,IL-17可能通過調(diào)控p38-MAPK、FAK 和MMP-1參與的細胞骨架改建最終導(dǎo)致牙周膜細胞的遷移。 第三部分：IL-17和MMP-1在人及大鼠根尖周病變的表達情況研究 實驗四：IL-17和MMP-1在人慢性根尖周病變的表達情況研究 目的：檢測在人慢性根尖周病變IL-17和MMP-1的表達情況,分析兩者表達的 相互關(guān)系。 方法：從2013年1月至8月在武漢大學口腔醫(yī)院牙體牙髓科行根尖手術(shù)或頜面 外科拔牙患者中,收集到人慢性根尖周炎病損組織15例(其中根尖周肉芽腫10 例,囊腫5例)及正常根尖周組織標本4例。7例根尖周病損標本用于組織學、 免疫組化和免疫熒光染色研究,以觀察IL-17和MMP-1的表達情況。另外8例 根尖周病損標本及4例正常根尖周組織標本采用實時定量RT-PCR方法檢測 IL-17和MMP-1mRNA表達,并分析IL-17與MMP-1表達量之間的關(guān)系。 結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示IL-17和MMP-1均表達于人慢性根尖周肉芽腫及囊腫 中。免疫熒光染色指示表達IL-17與MMP-1的細胞存在不同,前者主要定位于 淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞等,后者除定位于炎性細胞外,還(?)成纖維樣 細胞和血管內(nèi)皮細胞上表達。此外,實時定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩者mRNA 的表達水平均高于正常對照組,且IL-17在根尖肉芽腫的表達量稍高于根尖周囊 腫,而MMP-1在根尖周囊腫的表達量則略高,但無統(tǒng)計學意義,IL-17表達與 MMP-1表達呈正相關(guān)。 結(jié)論：IL-17與MMP-1共同參與根尖周炎慢性期炎癥,提示兩者參與了慢性炎 癥的發(fā)展過程。 實驗五：IL-17和MMP-1在大鼠根尖周病變的表達情況研究 目的：檢測在大鼠根尖周病變IL-17和MMP-1的表達情況,探討兩者在病變發(fā) 展過程中的相互關(guān)系。 方法:將30成年雄性Sprague-Dawle大鼠開髓,分別于術(shù)后0、7、14、21、28 和35天取下頜骨,制備組織切片。HE染色觀察根尖周病變中炎癥變化：免疫組 織化學檢測IL-17和MMP-1的表達與變化,并用膠原染色分析根尖周基質(zhì)纖維變化。 結(jié)果：在大鼠根尖周炎模型中,正常組根尖周組織未見炎性細胞和IL-17及MMP-1陽性細胞,膠原纖維排列整齊；術(shù)后7天組根尖周可見少量炎性細胞浸潤,并有少量IL-17陽性細胞和MMP-1陽性細胞出現(xiàn)；術(shù)后14天IL-17陽性細胞和MMP-1陽性細胞增多,膠原結(jié)構(gòu)紊亂；術(shù)后21～28天,IL-17的表達量繼續(xù)增加,至21天達到峰值,MMP-1陽性細胞和中性粒細胞也持續(xù)增加；術(shù)后28-35天,IL-17及MMP-1陽性細胞數(shù)量恒定,有新生膠原合成,根尖周炎癥進入慢性期階段。IL-17陽性細胞和MMP-1陽性細胞數(shù)與根尖周炎進展相關(guān),且IL-17和MMP-1的表達呈正相關(guān)。 結(jié)論：IL-17與MMP-1共同參與根尖周炎急性及慢性期炎癥,提示兩者在疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸等病理過程中的起到一定作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.34

【共引文獻】

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本文編號：1607716