本文選題：Biodentine　切入點(diǎn)：人牙髓干細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：齲病是口腔的常見病，多發(fā)病之一。當(dāng)齲病發(fā)展至牙本質(zhì)時(shí)，細(xì)菌及其分泌的毒性產(chǎn)物可通過(guò)牙本質(zhì)小管侵入牙髓組織而導(dǎo)致其不同程度的損傷。當(dāng)損傷較嚴(yán)重時(shí)，原有的成牙本質(zhì)細(xì)胞死亡，牙髓發(fā)生炎癥，隨后牙髓組織中的牙髓干細(xì)胞（dentalpulp stem cells, DPSCs）增殖、遷移并黏附于損傷部位分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞（odontoblast-like cells, OBLCs），分泌修復(fù)性牙本質(zhì)，保護(hù)牙髓。因此DPSCs增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化是牙髓損傷修復(fù)和治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這為研究牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生提供了重大的契機(jī)。 Biodentine是牙髓治療領(lǐng)域的一種新興材料。其主要成分為硅酸三鈣、碳酸鈣、二氧化鋯、硅酸二鈣、氧化鈣、氧化鐵、氯化鈣和高分子聚合物的還原劑。與三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate, MTA）相比，Biodentine硬固時(shí)間短、微滲漏低和機(jī)械性能強(qiáng)。作為蓋髓劑能有效地隔絕外界因素刺激，保護(hù)牙髓組織，誘導(dǎo)DPSCs分化為OBLCs，形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，其在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程具有潛在的優(yōu)勢(shì)及臨床應(yīng)用前景。那么Biodentine能否誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化能力，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本課題在成功構(gòu)建hDPSCs細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，研究Biodentine在hDPSCs的增殖、遷移、黏附以及成牙/成骨分化過(guò)程中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制，為將來(lái)臨床活髓保存治療和人牙髓干細(xì)胞組織工程應(yīng)用提供新思路。主要的研究結(jié)果如下： 1.人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 我們選取年輕患者因正畸拔除的新鮮健康第三磨牙，用組織塊聯(lián)合酶消化法分離和培養(yǎng)原代人牙髓細(xì)胞，有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞，，擴(kuò)大培養(yǎng)獲得人牙髓干細(xì)胞系。利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，同時(shí)通過(guò)成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的多向分化潛能，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為高純度的人牙髓干細(xì)胞。 2. Biodentine對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響 制備Biodentine浸提液；通過(guò)MTT和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度Biodentine浸提液（0.02-20mg/ml）刺激二維平面hDPSCs后對(duì)其增殖能力的影響。MTT結(jié)果顯示，不同濃度Biodentine培養(yǎng)hDPSCs1、3、5和7天，0.2mg/ml和2mg/ml的Biodentine均可顯著促進(jìn)該細(xì)胞的增殖能力，Biodentine濃度為0.02mg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖與對(duì)照組比較沒有明顯的差異，而20mg/ml的Biodentine顯著抑制hDPSCs的增殖，對(duì)其有毒性作用。BrdU結(jié)果顯示，不同濃度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果與MTT結(jié)果一致。 3. Biodentine對(duì)人牙髓干細(xì)胞遷移和黏附能力的影響 我們通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)探索Biodentine對(duì)hDPSCs遷移的作用；采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)確定Biodentine對(duì)hDPSCs黏附能力的影響；利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)一步分析Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs黏附和遷移過(guò)程中，細(xì)胞趨化因子和黏附分子mRNA表達(dá)的情況。通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)0.2mg/ml的Biodentine明顯促進(jìn)hDPSCs的遷移能力；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Biodentine濃度為0.2mg/ml時(shí)能顯著提高h(yuǎn)DPSCs的黏附作用。此外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，0.2mg/ml的Biodentine可有效地影響細(xì)胞趨化因子和黏附分子在hDPSCs中的表達(dá)。 4. Biodentine在人牙髓干細(xì)胞分化中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究 首先，用不同濃度Biodentine分別礦化誘導(dǎo)hDPSCs1、3、7、10、14和21天，通過(guò)堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)在細(xì)胞分化過(guò)程中堿性磷酸酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine組堿性磷酸酶活性明顯高于對(duì)照組，而且14天時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰，提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期發(fā)揮重要的作用。然后我們通過(guò)堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Biodentine對(duì)hDPSCs成牙/成骨向分化的影響。結(jié)果顯示，0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine均可促進(jìn)該細(xì)胞向成牙/成骨分化的能力，其中以0.2mg/ml Biodentine更為顯著。以上結(jié)果證明Biodentine能有效地促進(jìn)hDPSCs的成牙/成骨向分化，但是相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚。 為了探索Biodentine調(diào)控hDPSCs成牙/成骨向分化的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步通過(guò)茜素紅染色、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，初步探討如核因子κB（nuclearfactor-kappa B, NF-κB）、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II（calcium/calmodulin dependent proteinkinase II, CaMKII）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路在Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs成牙/成骨向分化過(guò)程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)含有不同通路抑制劑的0.2mg/ml Biodentine礦化誘導(dǎo)hDPSCs14天后，NF-κB抑制劑（PDTC）顯著增強(qiáng)Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成、成牙/成骨基因OCN、DSPP、DMP1及BSP mRNA的表達(dá)和相關(guān)蛋白的活化，而CaMKII抑制劑（KN-93）和MAPK（ERK和JNK）抑制劑（U0126和SP600125）明顯抑制Biodentine誘導(dǎo)該細(xì)胞成牙/成骨向分化的能力，此外，MAPK（p38）抑制劑（SB203580）在Biodentine調(diào)控hDPSCs成牙/成骨向分化過(guò)程中不發(fā)揮作用。 綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一定濃度的Biodentine對(duì)人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化的能力有著不同程度的影響.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CaMKII和MAPK信號(hào)通路參與Biodentine調(diào)控人牙髓干細(xì)胞的成牙/成骨向分化，并發(fā)揮著重要的作用。這為研究人牙髓損傷和修復(fù)治療的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1590666