本文選題：Biodentine　切入點：人牙髓干細胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：齲病是口腔的常見病，多發(fā)病之一。當(dāng)齲病發(fā)展至牙本質(zhì)時，細菌及其分泌的毒性產(chǎn)物可通過牙本質(zhì)小管侵入牙髓組織而導(dǎo)致其不同程度的損傷。當(dāng)損傷較嚴重時，原有的成牙本質(zhì)細胞死亡，牙髓發(fā)生炎癥，隨后牙髓組織中的牙髓干細胞（dentalpulp stem cells, DPSCs）增殖、遷移并黏附于損傷部位分化為成牙本質(zhì)樣細胞（odontoblast-like cells, OBLCs），分泌修復(fù)性牙本質(zhì)，保護牙髓。因此DPSCs增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化是牙髓損傷修復(fù)和治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這為研究牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生提供了重大的契機。 Biodentine是牙髓治療領(lǐng)域的一種新興材料。其主要成分為硅酸三鈣、碳酸鈣、二氧化鋯、硅酸二鈣、氧化鈣、氧化鐵、氯化鈣和高分子聚合物的還原劑。與三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate, MTA）相比，Biodentine硬固時間短、微滲漏低和機械性能強。作為蓋髓劑能有效地隔絕外界因素刺激，保護牙髓組織，誘導(dǎo)DPSCs分化為OBLCs，形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，其在牙髓損傷修復(fù)過程具有潛在的優(yōu)勢及臨床應(yīng)用前景。那么Biodentine能否誘導(dǎo)人牙髓干細胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化能力，目前尚未見文獻報道。因此，本課題在成功構(gòu)建hDPSCs細胞系的基礎(chǔ)上，研究Biodentine在hDPSCs的增殖、遷移、黏附以及成牙/成骨分化過程中的作用及其相關(guān)的分子機制，為將來臨床活髓保存治療和人牙髓干細胞組織工程應(yīng)用提供新思路。主要的研究結(jié)果如下： 1.人牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 我們選取年輕患者因正畸拔除的新鮮健康第三磨牙，用組織塊聯(lián)合酶消化法分離和培養(yǎng)原代人牙髓細胞，有限稀釋法挑選單克隆細胞，，擴大培養(yǎng)獲得人牙髓干細胞系。利用流式細胞儀對細胞表面標(biāo)記物進行鑒定，同時通過成骨、成脂誘導(dǎo)實驗檢測細胞的多向分化潛能，證明所培養(yǎng)的細胞為高純度的人牙髓干細胞。 2. Biodentine對人牙髓干細胞增殖能力的影響 制備Biodentine浸提液；通過MTT和BrdU實驗檢測不同時間點不同濃度Biodentine浸提液（0.02-20mg/ml）刺激二維平面hDPSCs后對其增殖能力的影響。MTT結(jié)果顯示，不同濃度Biodentine培養(yǎng)hDPSCs1、3、5和7天，0.2mg/ml和2mg/ml的Biodentine均可顯著促進該細胞的增殖能力，Biodentine濃度為0.02mg/ml時，細胞增殖與對照組比較沒有明顯的差異，而20mg/ml的Biodentine顯著抑制hDPSCs的增殖，對其有毒性作用。BrdU結(jié)果顯示，不同濃度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小時，其檢測結(jié)果與MTT結(jié)果一致。 3. Biodentine對人牙髓干細胞遷移和黏附能力的影響 我們通過細胞劃痕和Transwell實驗探索Biodentine對hDPSCs遷移的作用；采用細胞黏附實驗確定Biodentine對hDPSCs黏附能力的影響；利用實時定量PCR技術(shù)進一步分析Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs黏附和遷移過程中，細胞趨化因子和黏附分子mRNA表達的情況。通過細胞劃痕和Transwell實驗，我們發(fā)現(xiàn)0.2mg/ml的Biodentine明顯促進hDPSCs的遷移能力；細胞黏附實驗結(jié)果表明Biodentine濃度為0.2mg/ml時能顯著提高hDPSCs的黏附作用。此外，實時定量PCR結(jié)果顯示，0.2mg/ml的Biodentine可有效地影響細胞趨化因子和黏附分子在hDPSCs中的表達。 4. Biodentine在人牙髓干細胞分化中的作用及其相關(guān)機制研究 首先，用不同濃度Biodentine分別礦化誘導(dǎo)hDPSCs1、3、7、10、14和21天，通過堿性磷酸酶試劑盒檢測在細胞分化過程中堿性磷酸酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine組堿性磷酸酶活性明顯高于對照組，而且14天時表達達到最高峰，提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期發(fā)揮重要的作用。然后我們通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和實時定量PCR檢測Biodentine對hDPSCs成牙/成骨向分化的影響。結(jié)果顯示，0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine均可促進該細胞向成牙/成骨分化的能力，其中以0.2mg/ml Biodentine更為顯著。以上結(jié)果證明Biodentine能有效地促進hDPSCs的成牙/成骨向分化，但是相關(guān)的分子機制尚不清楚。 為了探索Biodentine調(diào)控hDPSCs成牙/成骨向分化的分子機制，我們進一步通過茜素紅染色、實時定量PCR實驗和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，初步探討如核因子κB（nuclearfactor-kappa B, NF-κB）、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II（calcium/calmodulin dependent proteinkinase II, CaMKII）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路在Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs成牙/成骨向分化過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)含有不同通路抑制劑的0.2mg/ml Biodentine礦化誘導(dǎo)hDPSCs14天后，NF-κB抑制劑（PDTC）顯著增強Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成、成牙/成骨基因OCN、DSPP、DMP1及BSP mRNA的表達和相關(guān)蛋白的活化，而CaMKII抑制劑（KN-93）和MAPK（ERK和JNK）抑制劑（U0126和SP600125）明顯抑制Biodentine誘導(dǎo)該細胞成牙/成骨向分化的能力，此外，MAPK（p38）抑制劑（SB203580）在Biodentine調(diào)控hDPSCs成牙/成骨向分化過程中不發(fā)揮作用。 綜上所述，我們的實驗證實了一定濃度的Biodentine對人牙髓干細胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化的能力有著不同程度的影響.進一步研究發(fā)現(xiàn)CaMKII和MAPK信號通路參與Biodentine調(diào)控人牙髓干細胞的成牙/成骨向分化，并發(fā)揮著重要的作用。這為研究人牙髓損傷和修復(fù)治療的分子機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R781.1

【參考文獻】

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1 路娟英;高杰;麻丹丹;陳婷;;干細胞因子促進人乳牙牙髓干細胞增殖與向成骨方向分化[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年03期

2 劉培光,周道斌,沈悌;人骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定:抗SH2和SH3單克隆抗體的制備與應(yīng)用[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2005年04期

3 段華新;盧光t;程臘梅;;LFA-1和VLA-4參與人高增殖潛能內(nèi)皮祖細胞與血管內(nèi)皮的黏附和跨內(nèi)皮遷移[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2008年03期

4 劉鈺瑜,崔燎,吳鐵,姚衛(wèi)民,艾春媚,許碧連,鄒麗宜,林羽惠;大黃素對體外大鼠骨髓基質(zhì)細胞向脂肪細胞方向分化的影響[J];中國藥理學(xué)通報;2005年07期

5 張郁,蔭俊,史俊南,肖明振,陳建元,吳軍正;人牙髓成纖維細胞等的體外培養(yǎng)、生長特性和鑒定[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;1991年02期

6 魏廣治;;Biodentine在髓室底穿孔中的應(yīng)用研究[J];中國醫(yī)藥指南;2012年11期

7 趙何偉;王太洪;鄭蘇文;孫靜鋒;張業(yè)偉;;CD90蛋白的研究進展[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2012年09期

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