本文選題：P.gingivalis　切入點：Fim　出處：《錦州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的探討牙齦卟啉單胞菌菌毛(Porphyromonas gingivalis Fimbriae,P.gingivalis Fim A)融合蛋白對人外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)中TNF-α和IL-6表達的影響。方法1.收集對數(shù)期P.gingivalis菌液,提取細菌DNA,通過PCR克隆Fim A基因,構(gòu)建可原核表達質(zhì)粒PGEX-6P-Fim A,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,經(jīng)過不同時間、溫度及不同濃度IPTG誘導(dǎo),選取最佳條件誘導(dǎo)Fim A融合蛋白表達,通過谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶親和層析法,純化Fim A融合蛋白�？捡R斯亮藍染色和Western blot檢測蛋白的準(zhǔn)確性。2.于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院隨機選擇3例牙周健康志愿者,采集靜脈血提取PBMCs。設(shè)計不同的實驗組:a.分別設(shè)置不同的Fim A融合蛋白濃度(0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml和5μg/ml)刺激PBMCs 24 h;b.選取3μg/ml Fim A融合蛋白刺激PBMCs 0 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h。收集各組細胞上清,應(yīng)用ELISA法檢測TNF-α和IL-6的表達水平。結(jié)果1.經(jīng)考馬斯亮藍染色和Western blot檢測,成功純化出P.gingivalis Fim A融合蛋白。2.不同濃度的Fim A融合蛋白刺激PBMCs 24 h對細胞因子的影響:TNF-α中1μg/ml組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.362);其余各組間相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。IL-6中各組間相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.不同時間點3μg/ml Fim A融合蛋白刺激PBMCs對細胞因子的影響:TNF-α和IL-6各時間組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論P.gingivalis Fim A融合蛋白可以使PBMCs中TNF-α和IL-6致炎細胞因子上調(diào),為后續(xù)制備多克隆抗體和牙周病亞單位疫苗的研制提供了部分實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of Porphyromonas gingivalis Fimbriaeae P.gingivalis Fim A fusion protein on the expression of TNF- 偽 and IL-6 in peripheral Blood Mononuclear cells PBMCs.Methods 1.The bacterial DNA was extracted from P. gingivalis in logarithmic phase and the Fim A gene was cloned by PCR. The prokaryotic expression plasmid PGEX-6P-Fim A was constructed and transformed into Escherichia coli DH5 偽 competent cells. The expression of Fim A fusion protein was induced by different time, temperature and concentration of IPTG. Fim A fusion protein was purified by glutathione mercaptotransferase affinity chromatography. Coomassie brilliant blue staining and Western blot were used to detect the protein. 2. Three healthy volunteers were randomly selected from the second affiliated Hospital of Jinzhou Medical University. Blood was collected from vein blood to extract PBMCs. Different experimental groups were designed: a. Different concentrations of Fim A fusion protein were set at 0 渭 g / ml 1 渭 g / ml / ml 2 渭 g / ml / ml 3 渭 g / ml / ml and 5 渭 g / ml respectively) stimulated PBMCs 24 h / ml, 3 渭 g / ml Fim A fusion protein was selected to stimulate PBMCs 0 h / 8 h / h / 12 h / h / 16 h / h and 24 h / h. Cell supernatants were collected for 20 h and 24 h for PBMCs 0 h / 8 h ~ 12 h ~ (-1) h ~ (-1) / h ~ (-1) and 5 渭 g / ml ~ (-1) 渭 g / ml / ml respectively. Results 1. Coomassie brilliant blue staining and Western blot were used to detect the expression of TNF- 偽 and IL-6. P.gingivalis Fim A fusion protein .2.The effect of different concentrations of Fim A fusion protein on cytokines stimulated by PBMCs for 24 h in 1 渭 g / ml group of 1 渭 g / ml of 1 渭 g / ml of Fim A fusion protein was not significantly different from that in control group, but there was no significant difference among other groups. There was significant difference between the three groups in P0.05U. IL-6. The difference was statistically significant. The effect of PBMCs stimulated by 3 渭 g / ml Fim A fusion protein on cytokines at different time points: TNF- 偽 was compared with that of IL-6 at different time points. Conclusion P.gingivalis Fim A fusion protein can up-regulate TNF- 偽 and IL-6 inflammatory cytokines in PBMCs, which provides some experimental basis for the subsequent preparation of polyclonal antibody and periodontal disease subunit vaccine.
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：1581637