本文關(guān)鍵詞：涎腺腺樣囊性癌中BNIP3的表達(dá)與低氧自噬的關(guān)系及其臨床病理特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

HIF-1α/BNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬在唾液腺腺樣囊性癌中的作用

陳占偉  

【摘要】：唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是頭頸部唾液腺最常見的惡性腫瘤之一,具有嗜神經(jīng)生長、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率高及易發(fā)生全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等獨(dú)特的生物學(xué)行為。因此,腺樣囊性癌曾被描述為頭頸部最具破壞性和不可預(yù)見性的腫瘤之一。目前,對于腺樣囊性癌尚無行之有效的治療方案,主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療為主,近年來有術(shù)后行I125放射性粒子植入作為輔助放療的報(bào)道。雖然5年生存率較高,但其10年甚至更長時(shí)間生存率偏低,效果并不滿意。因此,進(jìn)一步了解腺樣囊性癌的生物學(xué)行為和分子遺傳學(xué)特征可能找提供新的見解和治療策略。近年來隨著對腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究的逐步深入,人們發(fā)現(xiàn)腺樣囊性癌的治療要想取得突破性進(jìn)展,需要尋找更具針對性的新目的基因,通過基因轉(zhuǎn)染抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡,是腫瘤基因治療策略之所在。低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境中常見的現(xiàn)象。腫瘤在高速增殖的過程中,血管生成速度顯著低于細(xì)胞增殖速度,氧供應(yīng)的速度滯后于細(xì)胞對氧的需求,現(xiàn)已有大量研究表明低氧狀態(tài)與腫瘤的侵襲性、血管再生、提高復(fù)發(fā)率及放化療耐受性之間存在復(fù)雜的聯(lián)系。作為氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子,HIF-1是在低氧條件下重要的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩種亞基組成的異源二聚體,HIF-1β是HIF-1的結(jié)構(gòu)性亞基,在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)相對穩(wěn)定；HIF-1α是HIF-1的功能亞基,常氧條件下不斷合成,同時(shí)不斷經(jīng)泛素-蛋白酶小體途徑水解。低氧條件下,HIF-1a降解受阻,在細(xì)胞漿內(nèi)積聚增多,向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,與HIF-1β結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1α已經(jīng)在大多數(shù)常見的人類癌癥中觀察到,如頭頸部的惡性腫瘤、卵巢癌和食道癌中,并與不良預(yù)后及治療抵抗相關(guān)。Costa等發(fā)現(xiàn)HIF-la廣泛的在唾液腺腺樣囊性癌中表達(dá),而在腫瘤附近正常唾液腺腺體組織鮮有表達(dá)。BNIP3,即Bcl2/腺病毒ElB 19 kDa相關(guān)蛋白3(BCL2/adenovirus ElB 19kDa interacting protein 3),屬于促凋亡蛋白,其表達(dá)受HIF-1 α依賴的缺氧的調(diào)節(jié)及其他很多因素的影響。BNIP3蛋白主要定位于線粒體外膜,當(dāng)其被激活后,完全整合入線粒體外膜,通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)損傷線粒體功能引起染色質(zhì)凝聚、DNA分解,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來,BNIP3的異常表達(dá)和很多腫瘤的進(jìn)展、化療耐藥及自噬密切相關(guān)。BNIP3的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子HIF-la的調(diào)控,在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡過程中起重要的作用。然而,唾液腺腺樣囊性癌中BNIP3的表達(dá)、其調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬通路及臨床病理學(xué)行為國內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。自噬指的是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹的部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等形成自噬體,與溶酶體融合后形成自噬溶酶體,進(jìn)一步降解所包裹的多余蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞成分,來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新,來維持自身的穩(wěn)定。其整個過程主要分3個階段：自噬小體的初步形成；自噬體膜的延伸；自噬體與溶酶體融合并降解。氯喹可以通過升高溶酶體內(nèi)的PH值,進(jìn)而阻止自噬體與溶酶體結(jié)合而抑制自噬。我們的研究團(tuán)隊(duì)在之前調(diào)查過79名患有頭頸部腺樣囊性癌的患者,觀察自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3) 和Beclin1的表達(dá),結(jié)果顯示二者在腺樣囊性癌形成的過程中起重要的作用。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)與誘導(dǎo)自噬之間存在某些聯(lián)系,然而低氧誘導(dǎo)腺樣囊性癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚未完全明確。目的：1、應(yīng)用二氯化鈷在體外構(gòu)建細(xì)胞低氧模型,采用經(jīng)其處理的腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-M細(xì)胞,模擬其在體內(nèi)的缺氧環(huán)境,觀察缺氧條件下低氧相關(guān)的HIF-1 α/BNIP3通路相關(guān)基因、自噬相關(guān)基因Beclin1在腺樣囊性癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討低氧對唾液腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞增殖和自噬的影響。2、采用二氯化鉆模擬低氧條件,研究低氧誘導(dǎo)的自噬對唾液腺腺樣囊性癌ACC-M侵襲性的影響,研究氯喹通過抑制低氧誘導(dǎo)的自噬過程而對ACC-M細(xì)胞侵襲性的影響。方法：1、應(yīng)用二氯化鈷作為化學(xué)性低氧誘導(dǎo)劑,體外構(gòu)建唾液腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞低氧模型。2、MTT法對ACC-M細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測驗(yàn),以檢測二氯化鈷對細(xì)胞增殖的抑制作用；透射電子顯微鏡觀察自噬體形成；雙免疫熒光標(biāo)記、RT-PCR及Western blot檢測低氧相關(guān)HIF-1α/BNIP3通路相關(guān)基因、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)及Beclin1的表達(dá),數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行two-tailedt檢驗(yàn),P0.05為差異具有顯著性。3、觀察比較經(jīng)二氯化鈷處理的ACC-M細(xì)胞和常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞的侵襲能力；然后用氯喹(10μM and 20μM)處理實(shí)驗(yàn)組ACC-M細(xì)胞,通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來對比實(shí)驗(yàn)組與對照組中癌細(xì)胞的侵襲能力。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行two-tailed t檢驗(yàn),P0.05為差異具有顯著性。結(jié)果：1、二氯化鈷可以降低ACC-M細(xì)胞的活性,同時(shí)可以誘導(dǎo)自噬體的形成；透射電子顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)可見到自噬體樣的雙層膜結(jié)構(gòu)；RT-PCR及Western blot檢測顯示二氯化鈷可明顯使HIF-1α/BNIP3信號通路的相關(guān)基因和自噬的表達(dá)顯著提高。2、與對照組相比,經(jīng)過二氯化鉆處理的ACC-M細(xì)胞在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組(p0.001)；而后在經(jīng)氯喹處理細(xì)胞侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,且劑量越高抑制作用越明顯(p0.01)。結(jié)論：1、二氯化鈷可以模擬低氧環(huán)境,從而誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生,同時(shí)HIF-1α/BNIP3信號通路在這個過程中扮演重要的角色。2、二氯化鈷可以通過誘導(dǎo)ACC-M的自噬過程來增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性；氯喹可以通過抑制低氧誘導(dǎo)的自噬過程來抑制腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞的侵襲。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

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本文編號：157545