本文關(guān)鍵詞： DDIT3 周期性張應(yīng)力 自噬 細(xì)胞凋亡 ATG5　出處：《青島大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:功能矯形是口腔頜面部畸形的重要早期矯治方法,主要通過矯形力牽張口腔頜面部肌肉發(fā)生適應(yīng)性改建以發(fā)揮治療效果。本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬應(yīng)力刺激方法,結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù),從微觀層面探討周期張應(yīng)力對(duì)成肌細(xì)胞的作用與機(jī)制。并針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3展開初步研究,旨在進(jìn)一步闡明功能矯形治療的作用機(jī)制,為臨床治療提供更完善的理論支持。方法:采用大鼠L6成肌細(xì)胞株,體外培養(yǎng)并構(gòu)建成肌細(xì)胞體外-力學(xué)刺激模型;細(xì)胞分別加載頻率為10 cycles/min,拉伸變形率為15%的周期性張應(yīng)力2、6、12、24小時(shí),并以0h組(不加力)作對(duì)照,除應(yīng)力加載時(shí)間外其它條件均保持一致。采用Hochest 33258染色的方法觀察各組成肌細(xì)胞凋亡的情況;并應(yīng)用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測不同應(yīng)力加載時(shí)間對(duì)大鼠成肌細(xì)胞凋亡率的影響,運(yùn)用Real Time PCR和Western Blot分別檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3和凋亡相關(guān)基因BBC3的m RNA和蛋白表達(dá)變化,檢測各組成肌細(xì)胞的自噬相關(guān)基因LC3、P62、ATG5的蛋白表達(dá)量;利用3-MA自噬抑制成功劑抑制成肌細(xì)胞自噬后,結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析自噬抑制后細(xì)胞凋亡率的變化;采用si RNA干擾DDIT3的表達(dá),檢測干擾前后BBC3和ATG5的m RNA表達(dá)變化,并運(yùn)用Western Blot比較干擾DDIT3后BBC3和ATG5的蛋白變化相較各加力組的差異。以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1.經(jīng)Hoches染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠L6成肌細(xì)胞凋亡率,結(jié)果均表明成肌細(xì)胞加載頻率為10 cycles/min,拉伸變形率為15%的周期性張應(yīng)力后可誘發(fā)細(xì)胞凋亡,且凋亡率與應(yīng)力加載時(shí)長呈相關(guān)性,即隨應(yīng)力加載時(shí)間延長大鼠成肌細(xì)胞凋亡率明顯上升,并且在應(yīng)力加載24h時(shí)達(dá)到最高。2.RT-PCR結(jié)果顯示:隨應(yīng)力加載時(shí)間延長DDIT3和BBC3的m RNA表達(dá)量逐漸上升,并在加力24h時(shí)達(dá)最高值,Western Blot檢測DDIT3和BBC3的蛋白表達(dá)結(jié)果也呈現(xiàn)與應(yīng)力加載時(shí)間正相關(guān)的趨勢(p0.05)。3.Western Blot結(jié)果提示LC3、ATG5的蛋白表達(dá)量與應(yīng)力加載時(shí)間呈正相關(guān),p62的蛋白表達(dá)量于2h先升高隨后呈下降趨勢(p0.05)。4.經(jīng)3-MA自噬抑制劑處理后的細(xì)胞在加力24h后,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測,其細(xì)胞凋亡率明顯高于未經(jīng)自噬抑制劑處理的24h加力組,(p0.05)。5.運(yùn)用si RNA成功干擾DDIT3后,RT-PCR檢測干擾前后BBC3和ATG5的m RNA表達(dá)結(jié)果顯示其表達(dá)量較加力24h組均明顯下降,(p0.05)。6.Western Blot檢測DDIT3干擾后的BBC3和ATG5的蛋白表達(dá)結(jié)果提示,BBC3和ATG5的蛋白表達(dá)水平均低于24h組,但較對(duì)照組甚至2小時(shí)組的表達(dá)量仍明顯偏高,(p0.05)。結(jié)論:1.拉伸幅度為15%,頻率為10 cycles/min的周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡;2.成肌細(xì)胞在周期性張應(yīng)力加載條件下的凋亡與應(yīng)力加載的時(shí)間呈正關(guān)性,即成肌細(xì)胞凋亡率隨加力時(shí)間的增長逐漸升高;3.應(yīng)力加載條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3表達(dá)水平升高,表明成肌細(xì)胞在周期性張應(yīng)力誘導(dǎo)下發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;4.周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞發(fā)生自噬,且自噬的強(qiáng)度與應(yīng)力加載時(shí)間呈現(xiàn)相關(guān)性,隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長自噬強(qiáng)度越強(qiáng);5.抑制應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞自噬后,細(xì)胞凋亡率明顯升高;6.DDIT3可能作為轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控BBC3的表達(dá)參與應(yīng)力介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡;通過調(diào)控ATG5的表達(dá)參與應(yīng)力介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞自噬。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of cyclic tensile stress on the apoptosis rate of myoblasts in rats after stress loading . Results : 1 . The expression level of BBC3 and ATG5 was significantly higher than that in the control group .

【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫文娜;賀苗;夏晨蕾;丁弦;張強(qiáng);王爽玉;王芳;張彩霞;姜文心;閻瀟;孫同正;余海波;袁曉;;自噬在應(yīng)力誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡中的作用初探[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2016年11期

2 宋錦t，

本文編號(hào)：1518534