本文關(guān)鍵詞： 口腔鱗狀細(xì)胞癌 侵襲 mi-218-5p CD44 微流控芯片　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,在我國OSCC的發(fā)病率約在3.6/10萬-8.0/10萬人之間。OSCC具有較早的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向,晚期可轉(zhuǎn)移至肺、肝、骨等器官,其五年生存率為50%左右。研究認(rèn)為發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞常位于侵襲前沿(Invasive front),與位于腫瘤主體的細(xì)胞相比,侵襲前沿的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力,許多導(dǎo)致腫瘤侵襲的分子事件比如蛋白水解酶的分泌、細(xì)胞增殖活性的增加、血管新生、細(xì)胞間黏附分子的改變等均在侵襲前沿被發(fā)現(xiàn)。因此,辨別并篩選出侵襲前沿細(xì)胞亞群可以使我們更深入地解析腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。在OSCC侵襲前沿研究方面,以往研究多局限于利用免疫組織化學(xué)染色方法分析侵襲前沿細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)標(biāo)志物的表達(dá),難以分離獲得這些位于侵襲前沿的癌細(xì)胞,無法對其進(jìn)行深入的分析。因此,在體外模擬OSCC組織在體內(nèi)的侵襲狀況,分離獲得侵襲前沿的癌細(xì)胞是解決這一問題的有效途徑。微流控芯片是一種在微米尺度的空間對流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù),與傳統(tǒng)技術(shù)相比較微流控技術(shù)是對哺乳動物細(xì)胞及其微環(huán)境進(jìn)行操控的理想平臺,它消耗低、通量高、仿生性強(qiáng),在一定程度上可以取代動物模型。本研究以微流控芯片為平臺分離獲得了侵襲前沿的OSCC細(xì)胞,并深入分析了促進(jìn)OSCC細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)的分子機(jī)制。遺傳和表觀遺傳因素均可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲性,最近研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(micro RNA,mi RNA)可以在表觀遺傳水平調(diào)控腫瘤侵襲。然而,mi RNA在OSCC侵襲前沿細(xì)胞的表達(dá)狀況及其促進(jìn)侵襲的機(jī)制目前尚未完全闡明。我們對在微流控芯片上分離獲得的OSCC侵襲前沿細(xì)胞進(jìn)行small RNA測序,揭示了mi RNA在侵襲前沿細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn),并探究了其調(diào)控分子信號通路,為闡明OSCC的侵襲侵襲機(jī)制提供一種新的視點(diǎn)。目的:以微流控芯片為平臺分離獲得OSCC侵襲前沿細(xì)胞,從表觀遺傳水平探討OSCC侵襲性增強(qiáng)的分子機(jī)制。方法:本研究采用的OSCC細(xì)胞株為UM-SCC6,采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的微流控芯片及其操作方法分離獲得UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞。具體操作如下:在微流控芯片上利用基質(zhì)膠通道分隔細(xì)胞培養(yǎng)通道和刺激誘導(dǎo)通道,將UM-SCC6接種在細(xì)胞培養(yǎng)通道,采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),在刺激誘導(dǎo)通道加入20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,誘導(dǎo)UM-SCC6細(xì)胞的侵襲,將侵襲通過基質(zhì)膠通道遷移至刺激誘導(dǎo)通道的細(xì)胞采用胰蛋白酶消化后,移到培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。上述誘導(dǎo)步驟連續(xù)重復(fù)3次,最終獲得UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞。采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞遷移能力;采用微流控芯片和Transwell小室考察細(xì)胞侵襲能力;采用細(xì)胞免疫熒光染色和Western blot檢測EMT經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá),如E-鈣粘蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin,Vim)和神經(jīng)鈣粘蛋白(Neural cadherin,N-cadherin);CCK8增殖實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞的增殖能力。采用Trizol法提取UM-SCC6-M和UM-SCC6的總RNA,送至Novogene公司進(jìn)行測序建庫和質(zhì)量控制,進(jìn)行small RNA測序分析。在對獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行基本分析后,對比UM-SCC6和UM-SCC6-M的差異表達(dá)mi RNAs,通過mi Randa對獲得的mi RNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測,并行KEGG富集分析。采用realtime PCR分析mi RNA的表達(dá);采用western blot檢測蛋白表達(dá);利用mimic和inhibitor的轉(zhuǎn)染研究mi RNA的功能,利用Western blot和熒光素酶報告系統(tǒng)確定mi RNA對CD44的調(diào)控作用和直接結(jié)合。利用ROCK蛋白的抑制劑Y27632來檢測mi R-218-5p對細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用與CD44-ROCK通路的關(guān)系。結(jié)果:基于微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)、分離,我們獲得了UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞,命名為UM-SCC6-M。不同于UM-SCC6的“鋪路石”樣,UM-SCC-M細(xì)胞之間連接較為松散,部分細(xì)胞形態(tài)呈類似成纖維細(xì)胞的細(xì)長形,有的具有長長的“偽足”,有的細(xì)胞呈“多角形”,形態(tài)學(xué)上UM-SCC6-M具有間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M具有比UM-SCC6強(qiáng)的遷移能力。在侵襲前沿微流控芯片體外模型中,經(jīng)過24、48、72和96小時的血清誘導(dǎo),UM-SCC6-M侵襲入基質(zhì)膠中的高度和面積比UM-SCC6顯著增加。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M侵襲過Matrigel膠膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。免疫熒光染色和Western blot表明E-cadherin蛋白水平在UM-SCC6-M顯著降低,而Vim和N-cadherin則顯著增高。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M的增殖能力與UM-SCC6相比較沒有顯著變化。因此,我們分離獲得了OSCC侵襲前沿細(xì)胞UM-SCC6-M,并證明其具有間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)和較強(qiáng)的侵襲能力。通過small RNA測序及分析,我們獲得了44個UM-SCC6和UM-SCC6-M表達(dá)差異的mi RNA,其中27個在UM-SCC6-M中表達(dá)降低。我們對mi RNAs靶基因的富集通路進(jìn)行KEGG富集,發(fā)現(xiàn)這些mi RNA調(diào)控許多腫瘤相關(guān)信號通路,最為顯著的是癌癥蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)信號通路。因此,我們將研究重點(diǎn)放到了影響腫瘤轉(zhuǎn)移的CD44信號通路。Realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD44的m RNA在UM-SCC6-M中的表達(dá)水平與UM-SCC6相似,western blot結(jié)果顯示CD44蛋白在UM-SCC6-M中的表達(dá)水平高于UM-SCC6,提示mi RNA可能調(diào)控了CD44在UM-SCC6-M中的表達(dá)。Small RNA測序結(jié)果顯示mi R-218-5p在UM-SCC6-M的表達(dá)水平下降,realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測序結(jié)果一致。通過mi Randa預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測mi R-218-5p在CD44的m RNA上有結(jié)合位點(diǎn),熒光素酶報告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了mi R-218-5p對CD44的m RNA的3’UTR區(qū)域的直接結(jié)合和調(diào)控作用,提示mi R-218-5p調(diào)控的CD44表達(dá)可能在OSCC侵襲中發(fā)揮一定的作用。我們采用mi R-218-5p的mimic和inhibitor干擾mi R-218-5p的表達(dá)水平,Western blot顯示mi R-218-5p的mimic和inhibitor可以影響CD44蛋白的表達(dá),基于微流控芯片和Transwell的侵襲實(shí)驗(yàn)均顯示mi R-218-5p的mimic顯著抑制UM-SCC6-M的侵襲,而mi R-218-5p的inhibitor則顯著促進(jìn)UM-SCC6的侵襲能力,同時mi R-218-5p的inhibitor的促侵襲作用可被CD44下游蛋白ROCK的inhibitor逆轉(zhuǎn),證明了mi R-218-5p可以調(diào)控CD44-ROCK信號通路。結(jié)論:我們發(fā)展了一種基于微流控芯片分離OSCC侵襲前沿細(xì)胞的方法,分離獲得了具有部分間質(zhì)細(xì)胞表型的OSCC細(xì)胞(UM-SCC6-M)。通過對UM-SCC6-M的深入研究,我們發(fā)現(xiàn)mi R-218-5p在侵襲前沿細(xì)胞表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致CD44-ROCK信號通路激活,從而侵襲性增強(qiáng)。ROCK抑制劑具有逆轉(zhuǎn)mi R-218-5p在侵襲前沿細(xì)胞下調(diào)導(dǎo)致侵襲性增強(qiáng)的效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.8

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本文編號：1494439