本文關(guān)鍵詞： 膠原支架 人牙髓干細(xì)胞 纖維內(nèi)硅化 成骨分化 骨再生　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤、骨質(zhì)疏松、創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等多種原因?qū)е碌墓侨睋p一直嚴(yán)重影響著人們的健康和生活質(zhì)量。盡管自體骨移植被認(rèn)為是骨缺損的最佳修復(fù)方法，但是仍存在供體有限、手術(shù)創(chuàng)傷、并發(fā)癥較多、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。而同種異體骨移植和異種骨移植，則由于免疫排斥、生物相容性較差等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中受到了很大的限制。因此尋找理想的骨替代材料，成為了骨缺損修復(fù)面臨的重要難題。隨著研究的不斷進(jìn)展，近年來(lái)基于干細(xì)胞的骨組織工程已在骨缺損修復(fù)材料的研制方面取得一系列重要的進(jìn)展。 為了實(shí)現(xiàn)功能化骨的再生，組織工程三大關(guān)鍵要素即種子細(xì)胞、支架材料和生物活性因子的選擇和整合至關(guān)重要。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成骨分化潛能，并已經(jīng)在骨組織的重建再生方面得到了廣泛的研究，然而細(xì)胞獲取困難、費(fèi)用高昂、創(chuàng)傷較大等問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，牙髓干細(xì)胞的獲取方法容易，獲取過(guò)程對(duì)患者造成的創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小，具有更高的克隆形成能力，并且已有研究表明牙髓干細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞并形成骨組織，因此牙髓干細(xì)胞有望替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，成為骨組織工程中理想的自體種子細(xì)胞。 除種子細(xì)胞以外，支架材料是骨組織工程的又一重要因素，常見(jiàn)的支架材料有金屬、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物等，然而現(xiàn)有的材料仍無(wú)法滿(mǎn)足理想組織工程支架材料的要求。I型膠原為骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分，具有良好的生物相容性，是骨組織工程中常用的支架材料，但是易降解和機(jī)械性能較差等問(wèn)題成為其應(yīng)用的掣肘。為了解決這一問(wèn)題，本課題組在前期研究中在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)了重組I型膠原支架的纖維內(nèi)硅化，顯著提高了膠原支架的機(jī)械性能和耐酶解性，并且證實(shí)該支架材料能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，，顯示了其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。 然而纖維內(nèi)硅化膠原是否能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的成骨分化，其分化特征如何，目前仍不清楚。因此本研究的目的是探索纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響，從而為纖維內(nèi)硅化膠原和牙髓干細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果 1.纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞活性的影響 從人牙髓中分離牙髓干細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、克隆形成能力、干細(xì)胞表面標(biāo)志物等方面對(duì)細(xì)胞干性進(jìn)行鑒定；通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和Propidium iodide檢測(cè)細(xì)胞凋亡壞死情況，評(píng)估纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)細(xì)胞粘附、伸展及細(xì)胞凋亡壞死特性的影響；通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖特性的影響。結(jié)果表明所分離培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞，克隆形成率為25%，間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90和CD105的表達(dá)為陽(yáng)性，造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34和CD45的表達(dá)為陰性；纖維內(nèi)硅化膠原組、未硅化膠原組和空白對(duì)照組中正常人牙髓干細(xì)胞所占百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；纖維內(nèi)硅化膠原組中人牙髓干細(xì)胞的DNA含量和S期細(xì)胞百分比均明顯高于未硅化膠原組和空白對(duì)照組（p＜0.05）。 2.纖維內(nèi)硅化膠原促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的體外實(shí)驗(yàn)研究 通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、蛋白免疫印跡、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、ALP活性檢測(cè)、茜素紅染色和馮庫(kù)薩染色，從多個(gè)角度評(píng)估纖維內(nèi)硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響。結(jié)果表明，與未硅化膠原組和陰性對(duì)照組相比，纖維內(nèi)硅化膠原組中的成骨標(biāo)志基因和蛋白成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor2，RUNX2）、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、ALP和I型膠原（type I collagen，COLI）的表達(dá)水平均明顯增高（p＜0.05）；纖維內(nèi)硅化膠原組中人牙髓干細(xì)胞內(nèi)ALP活性及礦化沉淀形成量明顯高于未硅化膠原組和陰性對(duì)照組（p＜0.05）。 3.纖維內(nèi)硅化膠原促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 分別構(gòu)建人牙髓干細(xì)胞與纖維內(nèi)硅化膠原及未硅化膠原的復(fù)合體，將各組細(xì)胞-支架復(fù)合體植入裸鼠皮下，8周后，進(jìn)行伊紅和蘇木精（hemotoxylin and eosin，HE）染色、茜素紅染色、馮庫(kù)薩染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察骨樣組織的形成情況。結(jié)果表明，纖維內(nèi)硅化膠原組中骨細(xì)胞、血管和骨樣組織的形成均明顯多于未硅化膠原組和陰性對(duì)照組（p＜0.05）；纖維內(nèi)硅化膠原組中礦化沉淀形成的量和成骨標(biāo)志蛋白OCN的表達(dá)水平均明顯高于未硅化膠原組和陰性對(duì)照組（p＜0.05）。 綜上所述，纖維內(nèi)硅化膠原支架具有良好的生物相容性，與普通膠原支架相比，能夠明顯促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖、成骨分化和礦化，該支架材料與人牙髓干細(xì)胞復(fù)合后能夠在動(dòng)物體內(nèi)取得良好的成骨效果。纖維內(nèi)硅化膠原和人牙髓干細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用有望為臨床骨缺損的修復(fù)治療提供一種新的選擇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R783.3

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1482354