本文關(guān)鍵詞：正畸治療前后患者口內(nèi)菌群變化檢測(cè)與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

研究背景：

有報(bào)道顯示我國(guó)兒童與青少年的錯(cuò)牙合畸形患病率為67.82％［1］。頜面部畸形直接影響到兒童頜面部生長(zhǎng)發(fā)育、口腔健康、功能和容貌外觀以及心理健康。正畸矯治的病患隨著生活水平的增加也逐年增多。正畸固定矯治中，很多患者在矯治過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)牙齒表面釉質(zhì)脫礦的現(xiàn)象。有研究顯示，，牙齒表面釉質(zhì)在固定正畸矯治過(guò)程的脫礦率大約為 2-97%[2, 3]。這些現(xiàn)象可能與正畸矯治器的粘接有關(guān)，因?yàn)樵诠潭ǔC治過(guò)程中牙齒上需要粘接托槽、帶環(huán)等矯治附件，這些附件可能會(huì)使牙齒表面清潔受限、軟垢滯留，從而影響口腔健康。但是在臨床治療過(guò)程中我們也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，有些正畸固定矯治的患者雖然在矯治過(guò)程中軟垢很多、口腔衛(wèi)生很差，而且矯治時(shí)間較長(zhǎng)，牙面也未出現(xiàn)明顯的脫礦現(xiàn)象[11]。那么在固定正畸矯治過(guò)程中的釉質(zhì)脫礦的原因是什么呢？本研究從微生物學(xué)方面對(duì)正畸患者佩戴矯治器前后進(jìn)行菌群測(cè)定，分析正畸患者在固定正畸矯治前后口腔菌群的變化及其與口腔健康的關(guān)系。

研究目的：探討正畸固定矯治前后患者口內(nèi)菌群的變化；將患者口腔菌群的變化與患者口腔健康相聯(lián)系研究?jī)烧咧g的相關(guān)性。

研究方法：

從 2013 年8月-2014患者中隨機(jī)選取口內(nèi)牙齒沒(méi)有明顯脫礦患者20名，于正畸矯治前刮取其上頜前牙牙區(qū)菌斑，分為未治療組組；選取正畸治療超過(guò)六個(gè)月并且前牙未出現(xiàn)明顯脫礦且口腔健康狀況良好患者20名，取同樣區(qū)域菌斑為正畸治療組。年8月間在山東大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科正在進(jìn)行固定正畸矯治。

取牙面菌斑樣本，菌斑基因組DNA提取后PCR擴(kuò)增，最后對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序和分析，檢測(cè)正畸前后口內(nèi)菌群的變化情況。

結(jié)果：

研究結(jié)果顯示來(lái)自正畸治療組的菌斑多樣性與未治療組沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)測(cè)得口腔內(nèi)約有238個(gè)不同的細(xì)菌菌屬與維持口腔微生態(tài)平衡有關(guān)。其中10個(gè)屬的

細(xì)菌含量較高，占整個(gè)口腔的70％，分別是Parascardovia，Rothia, Corynebacterium, Leptotrichia, Streptococcus, Selenomonas, Prevotella, Capnocytophaga,

Hylemonella。通過(guò)將正畸前后牙面菌斑比較，我們發(fā)現(xiàn)有6個(gè)屬的細(xì)菌存在差異。6個(gè)屬的細(xì)菌包括在Parascardovia, Leptotrichia, Corynebacterium，Streptococcus，Selenomonas, 以及Prevotella。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正畸治療前后菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異性，多種菌屬與齲病的發(fā)生可能存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系，而這種菌屬的改變?cè)谂R床并未引起相應(yīng)口腔健康的改變，我們可以認(rèn)為在正畸治療以后口腔內(nèi)微生物菌群建立了一個(gè)新的穩(wěn)定生物體系。

結(jié)論：

患者戴用固定矯治器后，出現(xiàn)了局部牙面菌斑中Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes, 以及Lactobacillus總菌群中含量明顯增高的情況。本研究結(jié)果提示，患者戴用正畸固定矯治器后，局部牙面菌斑中的菌群構(gòu)成發(fā)生改變，并且進(jìn)入一種新的穩(wěn)定平衡狀態(tài)。

關(guān)鍵詞： 固定正畸治療 16S rDNA 菌屬含量

前言

臨床上正畸患者的口腔衛(wèi)生的保持一直是比較難以維持的。在臨床上我們就經(jīng)常發(fā)現(xiàn)許多固定正畸矯治的患者在矯治過(guò)程就發(fā)生了牙面脫礦的現(xiàn)象。顯然這與牙面菌斑在固定正畸矯治的附件周?chē)奂幸欢ǖ年P(guān)系[4, 5]�？赡苁且�?yàn)樵谡委熯^(guò)程中會(huì)出現(xiàn)口內(nèi)菌群的紊亂，牙周治病菌以及致齲菌比例增多的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致牙周炎以及釉質(zhì)脫礦的發(fā)生。有研究顯示，固定矯治過(guò)程中發(fā)生釉質(zhì)脫礦的概率大約為2-97% [2, 3]，其主要表現(xiàn)為脫礦牙釉質(zhì)表面光澤度下降呈白堊色，影響美觀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致齲的發(fā)生[4]。也有調(diào)查顯示固定矯治器粘接6個(gè)月內(nèi)脫礦的發(fā)生率明顯增加，6-12個(gè)月間脫礦發(fā)生率也會(huì)有所上升[1] 。

另一方面在臨床治療過(guò)程中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，有些接受正畸固定矯治的患者即使在矯治過(guò)程中軟垢很多、口腔衛(wèi)生很差，同時(shí)矯治時(shí)間較長(zhǎng)，牙面也未出現(xiàn)明顯的脫礦現(xiàn)象以及牙周疾病，在這種情況下口腔內(nèi)菌群又發(fā)生了什么樣的變化？

本實(shí)驗(yàn)使用16S rDNA測(cè)序的方法，分析口腔菌群在正畸前后發(fā)生的變化。16S rRNA位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上，包括10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域，保守區(qū)在細(xì)菌種屬之間沒(méi)有很大的差距，而高變區(qū)域在細(xì)菌種屬之間有明顯的差異。因此，16S rDNA可以做作為分別生物物種的特征核酸序列，已經(jīng)被廣發(fā)認(rèn)為是可以較快且準(zhǔn)確分析細(xì)菌系統(tǒng)和分類鑒定的指標(biāo)。以往454測(cè)序平臺(tái)以讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于16S rDNA測(cè)序領(lǐng)域，但是隨著MiSeq平臺(tái)雙端PE250和PE300測(cè)序策略的發(fā)展，讀長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)，使得基于MiSeq測(cè)序研究物種多樣性的準(zhǔn)確性大幅度提高[7]，所以已經(jīng)成為研究微生物群落多樣性的首選之策[8,9]。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法， 構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads拼接過(guò)濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品物種構(gòu)成；進(jìn)一步的α多樣性分析(Alpha Diversity)，β多樣性分析(Beta Diversity)可以分析樣品之間的差異。

本研究從微生物學(xué)方面應(yīng)用16S rDNA測(cè)序的方法對(duì)正畸患者佩戴矯治器前后進(jìn)行菌群測(cè)定，分析在正畸固定矯治前后患者口內(nèi)菌群的差異及其影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

（1）PBS緩沖液（上海研域試劑有限公司）

（2）Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs公司）

（3）GC緩沖液（New England Biolabs公司）

（4）DNA純化回收試劑盒 （北京天根生化科技有限公司）

（5）藍(lán)白斑篩選試劑（上海生工生物工程有限公司）

（6）胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（上海生工生物工程有限公司）

（7）Eppendorf 管（海門(mén)市盛邦實(shí)驗(yàn)器材有限公司）

1.2主要儀器設(shè)備

（1）DL—CJ—IN型高性能超凈工作臺(tái) （哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司）

（2）MLS—3750型高壓滅菌器 （日本SANYO公司）

（3）MDF一382E型超低溫冰箱 （日本SANYO公司）

（4）TGL_16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）

（5）ND一2000C型微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司）

（6）PowerPac 3000型Bio—rad電泳儀（美國(guó)BIO．RAD公司）

（7）1 70—4406型小型水平電泳槽（美國(guó)BIO．RAD公司 ）

（8）GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO．RAD公司）

（9）LightCycler 480 Real—Time PCR儀（瑞士Roche公司）

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