發(fā)布時間：2018-01-19 07:18

  本文關(guān)鍵詞： 人臍帶間充質(zhì)干細胞 明膠-PEG復(fù)合水凝膠 體外降解 預(yù)測模型 成骨分化 牙周骨組織工程　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:牙周病是危害人類口腔健康的重要疾病,目前臨床上牙周病的主要治療手段包括基礎(chǔ)治療、結(jié)合藥物治療、牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)及植骨術(shù)、生長因子治療等,盡管取得了一定的牙周組織再生效果,但是仍然無法滿足口腔臨床對牙周骨組織修復(fù)的要求。干細胞移植為牙周疾病的治療帶來了希望,然而由于病變部位微環(huán)境的改變使得移植的干細胞存活率低、活性差,治療效果有待提高。組織工程化治療借助生物材料能夠改善干細胞的生存微環(huán)境,從而有希望進一步提高干細胞移植治療的效果。明膠(Gelatin)水凝膠由于具有良好的生物相容性以及生物可降解性已經(jīng)被廣泛研究,已有研究表明聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)作為增塑劑可以顯著改善明膠水凝膠的機械特性,因此明膠-PEG復(fù)合水凝膠在牙周骨組織修復(fù)上可能具有一定的應(yīng)用潛力。水凝膠的降解是組織工程支架的重要特性,它需要與組織修復(fù)相匹配。然而,明膠-PEG復(fù)合水凝膠的降解規(guī)律目前還不清楚,此外復(fù)合水凝膠對人臍帶華頓氏膠來源的間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells,WJ MSCs)的親和性及成骨分化的影響還有待考察。目的:制備明膠-PEG復(fù)合水凝膠,明確主要制備參數(shù)對復(fù)合水凝膠降解的作用規(guī)律,并考察復(fù)合水凝膠對WJ MSCs粘附、生長及成骨分化的影響。方法:首先確定復(fù)合水凝膠的制備及其降解表征方法,即無菌條件下利用戊二醛(glutaraldehyde,GA)交聯(lián)明膠及PEG的混合溶液,4℃交聯(lián)18h,形成穩(wěn)定的復(fù)合水凝膠,利用I型膠原酶溶液浸泡復(fù)合水凝膠,進行體外酶降解,之后進行真空干燥,恒重后稱重,計算水凝膠的降解率。之后,采用Plackett-Burman實驗設(shè)計從明膠濃度(X_1)、戊二醛濃度(X_2)、PEG濃度(X_3)中確定影響復(fù)合水凝膠降解的顯著性因素。然后,利用響應(yīng)面方法之Box-Behnken實驗設(shè)計考察三因素X_1、X_2、X_3間交互作用對響應(yīng)值Y(復(fù)合水凝膠降解率)的影響,獲得復(fù)合水凝膠降解率的預(yù)測模型。之后,隨機選取三個復(fù)合水凝膠制備組合條件,考察模型預(yù)測值與實際降解率之間的吻合程度,以評價模型預(yù)測的準確性。接下來,將WJ MSCs接種到不同條件的水凝膠表面,利用細胞計數(shù)法考察干細胞初始粘附數(shù)量,通過活死染色觀察細胞活性及分布,使用F-actin熒光染色評價干細胞在水凝膠上的粘附和伸展,并利用CCK-8法考察干細胞在水凝膠表面的增殖。最后,使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對水凝膠表面的干細胞進行成骨誘導(dǎo),利用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)定量檢測及茜素紅染色考察水凝膠對WJ MSCs成骨分化的影響。顯著性因素篩選和響應(yīng)面設(shè)計實驗分別采用Minitab和Design-Expert來進行分析,其他數(shù)據(jù)采用Origin 8.5繪圖統(tǒng)計軟件分析。結(jié)果:1.戊二醛濃度是影響明膠-PEG復(fù)合水凝膠降解的顯著性因素。2.獲得預(yù)測復(fù)合水凝膠降解率數(shù)學(xué)模型:Y=2.23625-0.13467*X_1-14.52844*X_2+0.061178*X_3+0.043950*X_1*X_2-0.00379432*X_1*X_3+0.23396*X_2*X_3+0.00975590*X_12+27.47820*X_22-0.023016*X_32,該方程的R2等于0.97,p值小于0.0001,表明該回歸方程具有可靠的預(yù)測能力。3.實際降解率與模型預(yù)測值間的吻合度大于80%,說明該模型的可信度高。4.PEG對復(fù)合水凝膠支架降解的影響是受戊二醛濃度高低調(diào)控的,當戊二醛濃度高時,PEG的加入會顯著加速水凝膠的降解;而戊二醛濃度低時,PEG會減慢水凝膠的降解過程。5.與常規(guī)無PEG的水凝膠相比,復(fù)合水凝膠對干細胞粘附、活性及增殖無顯著性差異,然而復(fù)合水凝膠具有較致密的結(jié)構(gòu)。6.與常規(guī)二維培養(yǎng)表面相比,水凝膠表面能夠顯著提高ALP活性并促進鈣沉積,從而顯著促進干細胞的成骨分化,另外還發(fā)現(xiàn)與常規(guī)無PEG的水凝膠相比,PEG的添加并未顯著影響成骨分化的程度。結(jié)論:本研究明確了戊二醛濃度是影響明膠-PEG復(fù)合水凝膠降解的顯著性因素,并建立了一個信度高的、可預(yù)測降解率的數(shù)學(xué)模型,這使得制備具有特定降解速率的復(fù)合水凝膠成為可能。另外,PEG對復(fù)合水凝膠降解的影響可能是受戊二醛及明膠濃度高低調(diào)控的,并且PEG的添加能夠使得水凝膠結(jié)構(gòu)更加致密。此外,復(fù)合水凝膠表面干細胞的生長、粘附及活性較好,證明復(fù)合水凝膠與干細胞有很好的親和性,可作為干細胞移植的載體。此外,復(fù)合水凝膠能夠促進干細胞向成骨細胞分化。從而本研究為明膠-PEG復(fù)合水凝膠在修復(fù)牙周骨組織缺損研究中提供了新方法、新思路。
[Abstract]:Background: periodontal disease is an important disease endangering the health of human oral cavity, the periodontal disease is mainly clinical treatments including basic treatment, combined with drug therapy, periodontal guided tissue regeneration and bone grafting, growth factor treatment, despite certain periodontal tissue regeneration effect, but still can not meet the requirements of oral clinical periodontal bone tissue repair. Stem cell transplantation for the treatment of periodontal disease has brought hope, but because the lesion microenvironment change of transplanted stem cells survival rate is low, poor activity, treatment needs to be improved. The treatment by means of tissue engineering biomaterials can improve the survival of stem cells and micro the environment, and is expected to further improve the effect of stem cell transplantation in the treatment of gelatin hydrogel (Gelatin). Due to its good biocompatibility and biodegradability have been widely studied, the existing research This study showed that the polyethylene glycol (Polyethylene glycol, PEG) as the plasticizer can significantly improve the mechanical properties of gelatin gel, therefore gelatin -PEG composite hydrogel has a certain potential possible in periodontal bone tissue repair. The degradation of the hydrogel is characteristic to tissue engineering scaffold, tissue repair and it needs to match. However, the degradation of gelatin -PEG composite hydrogel is unclear, in addition to the composite hydrogel on human umbilical cord Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells (human umbilical cord Wharton jelly derived mesenchymal stem 's cells, WJ MSCs) affinity and osteogenic differentiation in vitro remains to be investigated. Objective: To study the preparation of gelatin -PEG composite hydrogel, clear the main preparation parameters of composite hydrogel degradation, and the effects of WJ composite hydrogel MSCs adhesion, proliferation and osteogenic differentiation. Methods: first To determine the preparation of composite hydrogel and its degrading characterization methods, namely under aseptic conditions by using glutaraldehyde (glutaraldehyde, GA) mixed solution cross-linked gelatin and PEG, 4 C crosslinked 18h composite hydrogel formation, stability, using type I collagenase solution composite hydrogel, enzymatic degradation in vitro, after vacuum drying, constant weight after weighing the degradation rate of hydrogel, calculated by Plackett-Burman. After the experimental design from the concentration of gelatin (X_1), the concentration of glutaraldehyde (X_2), PEG concentration (X_3) in determining the significance of influence factors of composite hydrogel degradation. Then, the response surface method of Box-Behnken experimental design of three factors of X_1, using X_2, X_3 interactions on the the response value of Y (composite hydrogel degradation rate) influence, obtained composite hydrogel degradation rate prediction model. Then, three randomly selected composite hydrogel preparation conditions, effects of model prediction and The degree of correspondence between the actual degradation rate, with an accuracy evaluation model prediction. Then, the WJ MSCs was inoculated into the hydrogel surface in different conditions, by using cell counting method was used to investigate the amount of stem cell initial adhesion, observe cell activity and distribution by live / dead staining, staining of adherent cells in the evaluation of dry hydrogel and extension using F-actin fluorescence. And the effects of stem cell proliferation in the hydrogel surface by CCK-8 method. Finally, the use of osteogenic medium on the surface of the hydrogel stem cells by osteogenic induction, alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase, ALP) quantitative detection and alizarin red staining of hydrogel on osteoblastic differentiation of WJ MSCs. The significant factor screening and response design experiment using Minitab and Design-Expert to analyze other data analysis using Origin 8.5 statistical software. Results: 1. drawing two amyl aldehyde concentration is Influencing factors of gelatin -PEG composite hydrogel degradation of.2. composite hydrogel degradation rate prediction mathematical model of the equation: Y=2.23625-0.13467*X_1-14.52844*X_2+0.061178*X_3+0.043950*X_1*X_2-0.00379432*X_1*X_3+0.23396*X_2*X_3+0.00975590*X_12+27.47820*X_22-0.023016*X_32, R2 = 0.97, P value is less than 0.0001, indicated that the regression equation has the ability of.3. to predict actual degradation rate and forecasting model of reliable value of the degree of agreement is greater than 80%, indicating the influence of the credibility of the model high.4.PEG of composite hydrogel scaffold degradation by glutaraldehyde concentration control, when the concentration of glutaraldehyde is high, the addition of PEG can significantly accelerate the degradation of hydrogels; while the glutaraldehyde concentration is low, PEG will slow down the degradation process of.5. hydrogel and conventional PEG hydrogel composite hydrogel compared to stem cell adhesion, proliferation activity and no significant difference However, the structure of.6. composite hydrogel with dense surface compared with conventional two-dimensional culture, the hydrogel surface can significantly improve ALP activity and promote calcium deposition, thus significantly promote the osteogenic differentiation of stem cells, it is also found that compared with the conventional PEG hydrogels, the addition of PEG did not significantly affect the osteogenic differentiation degree. Conclusion this study defined the glutaraldehyde concentration are significant factors that influenced the degradation of gelatin -PEG composite hydrogel, and the establishment of a reliable, predictable mathematical model of the degradation rate, which makes the composite hydrogel prepared with specific degradation rate as possible. In addition, the effect of PEG on the composite hydrogel degradation may be affected by glutaraldehyde and gelatin concentration control, and the addition of PEG can make the structure more compact hydrogel composite hydrogel surface. In addition, stem cell growth, adhesion and good activity, Proof of composite hydrogel and stem cells have good compatibility, can be used as carrier of stem cell transplantation. In addition, the composite hydrogel can promote stem cells to differentiate into osteoblasts. Thus the research of gelatin -PEG composite hydrogel provides a new method in the study of repairing periodontal bone defects in new ideas.

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4

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本文編號：1443177