發(fā)布時(shí)間：2018-01-18 10:39

  本文關(guān)鍵詞：牙髓干細(xì)胞在鼠尾膠原和鈦金屬表面生物學(xué)特性比較研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的:目前DPSCs生物學(xué)特征的研究多為干細(xì)胞的定向分化研究。因此,本實(shí)驗(yàn)主要研究目的為DPSCs在鼠尾膠原蛋白和鈦金屬上的細(xì)胞表型特點(diǎn)、細(xì)胞活性、礦化潛能、組織再生能力、多向分化潛能的體外生物學(xué)特性比較。實(shí)驗(yàn)方法:完整拔除牙根尚未發(fā)育完全的正畸牙或從未有牙體牙周疾病的第三磨牙(16-28歲),用組織塊發(fā)原代培養(yǎng)DPSCs,之后分組。分三組,空白對(duì)照組,正常培養(yǎng)(10%FBS+α-MEM培養(yǎng)液);實(shí)驗(yàn)組A:加入鼠尾膠原蛋白和10%FBS+α-MEM培養(yǎng)液;實(shí)驗(yàn)組B:加入鈦金屬和10%FBS+α-MEM培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察三組DPSCs原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)和傳代特征。之后將三組P2細(xì)胞接種于蓋玻片上,用熒光免疫技術(shù)檢測(cè)DPSCs表明標(biāo)記物STRO-1的表達(dá)情況。再將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的三組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,接種至6孔板中,培養(yǎng)7D后,加入結(jié)晶紫染液染色,觀察細(xì)胞克隆形成情況。采用MTT法分別連續(xù)10D測(cè)定三組DPSCs的P3細(xì)胞的OD值,繪制三組DPSCs的生長(zhǎng)曲線。在取三組P2細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液下進(jìn)行培養(yǎng),觀察到脂滴形成后使用油紅-O染色。對(duì)經(jīng)礦化誘導(dǎo)4W后的三組細(xì)胞進(jìn)行西紅素染色,并行半定量測(cè)定兩組干細(xì)胞的鈣含量以比較鼠尾膠原蛋白和鈦金屬對(duì)DPSCs礦化結(jié)節(jié)形成能力的影響。對(duì)礦化誘導(dǎo)4W后的三組DPSCs采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)成骨標(biāo)志堿性磷酸鹽(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎磷蛋白(bone sialophosphoprotein,BSP)、牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、骨鈣素(osteocalcin,OC)的表達(dá)情況。應(yīng)用熒光定量PCR儀7900分別檢測(cè)三組DPSCs礦化誘導(dǎo)3D,14D,21D的ALP、BSP、DSP、OC基因的m RNA表達(dá)水平,定量比較鼠尾膠原蛋白和鈦金屬對(duì)干細(xì)胞體外成骨/成牙骨質(zhì)能力的影響。結(jié)果:連續(xù)培養(yǎng)7D后,倒置顯微鏡下三組均可見(jiàn)有貼壁細(xì)胞以組織塊為中心成放射狀生長(zhǎng)。三組中的大部分細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng),呈梭狀,輪廓清晰,大小基本一致。對(duì)P0的三組DPSCs爬片進(jìn)行抗STRO-1免疫熒光檢測(cè),鏡下三組DPSCs細(xì)胞核均呈藍(lán)色熒光,胞漿呈綠色熒光,是陽(yáng)性表達(dá)。培養(yǎng)7D后進(jìn)行結(jié)晶紫染液染色,鏡下均可見(jiàn)有明顯的細(xì)胞集形成,其中A組克隆形成率為8.5%,B組為5%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,A組形成率高于B組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。DPSCs的生長(zhǎng)曲線呈“S”型,1-2D是潛伏期,3-8D為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞加速生長(zhǎng),8D后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩,符合干細(xì)胞慢周期的特點(diǎn),P4開(kāi)始A組和B組相比較,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。三組DPSCs體外誘導(dǎo)成脂3W后進(jìn)行油紅-O染色均呈陽(yáng)性,倒置顯微鏡下觀察到有明顯的紅色脂滴形成。礦化誘導(dǎo)4W后,三組細(xì)胞使用茜素紅染色法檢測(cè),可見(jiàn)有橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成。茜素紅半定量檢測(cè)三組細(xì)胞的鈣含量,其中A組的鈣含量為5.89±0.41,明顯高于B組的3.83±0.27,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。對(duì)礦化誘導(dǎo)4W后的DPSCs進(jìn)行抗ALP、BSP、DSP、OC的免疫熒光檢測(cè),結(jié)果為陽(yáng)性,其中A組熒光強(qiáng)度明顯高于其他2組。熒光定量PCR結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,BSP、DSP和OC基因水平表達(dá)上升,而ALP基因水平表達(dá)則隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而下降,且A組中的各基因的m RNA表達(dá)水平均高于其他2組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功地對(duì)人恒牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),并且在體外分別對(duì)鼠尾膠原蛋白和鈦金屬對(duì)恒牙牙髓干細(xì)胞的成骨性/牙源性的分化及相關(guān)成骨標(biāo)志物的鑒定和比較,并證實(shí)了鼠尾膠原蛋白對(duì)DPSCs關(guān)于以上綜述各指標(biāo)的影響和促進(jìn)作用。
[Abstract]:In this study , three groups of DPSCs were cultured under an inverted microscope . The results showed that the expression of ALP , BSP , DSP and OC increased with the increase of induction time . The results showed that the expression of ALP , BSP , DSP and OC increased with the increase of induction time .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R783.1

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本文編號(hào)：1440616