本文關(guān)鍵詞：富自體CGF纖維蛋白膜對體外培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,其在一定條件下能夠向特定的細(xì)胞類型分化,有作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程,達(dá)到修復(fù)和重建牙髓組織及形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的潛能。富自體濃縮生長因子(Concentrated Growth Factors,CGF)纖維蛋白被認(rèn)為是第三代血小板濃縮物,其通過不間斷差速離心自體靜脈血制備而成。CGF中含有多種生長因子,已有研究證實其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖及礦化具有促進(jìn)作用。目的:采用酶消化法體外分離培養(yǎng)、鑒定人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs),分別通過CCK-8法及堿性磷酸酶定量試劑盒檢測不同濃度富CGF纖維蛋白膜對HDPSCs增殖及礦化的作用,為HDPSCs及富自體CGF纖維蛋白膜的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法:1 HDPSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定選取實驗志愿者,年齡18-25歲,身體健康,口腔衛(wèi)生良好,具有拔除阻生齒的指征及需求。志愿者均在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科行智齒拔除術(shù),拔除的智齒需健康完整,無齲壞,無隱裂,無根尖周組織病變。采用酶消化法對牙髓組織進(jìn)行原代培養(yǎng),培養(yǎng)液為含15%胎牛血清的高糖DMEM。待細(xì)胞長滿80%后,即可對細(xì)胞進(jìn)行傳代,首次傳代以1:1傳代,以后按1:3傳代。采用流式細(xì)胞儀對HDPSCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定;繪制細(xì)胞生長曲線;通過對細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),茜素紅及油紅O染色來鑒定HDPSCs的多向分化能力。2 CGF纖維蛋白膜制備及分組9 ml Medifuge離心機特殊匹配真空采血試管采取志愿者靜脈血,將試管立即置入Medifuge離心機,設(shè)置CGF程序,差速離心13分鐘后即可得到富CGF纖維蛋白凝塊,此時可見采血管內(nèi)血液分為三層,上層為血清,底層為紅細(xì)胞,中間層即為富CGF纖維蛋白。棄去上層血清,將CGF層與底層紅細(xì)胞自交界處分離,將CGF多余液體擠出,便可得到富CGF纖維蛋白膜,將纖維蛋白膜剪成3×3mm大小,置于無菌生理鹽水中備用。不同濃度的CGF分別加入到不同的實驗組中,將加入一片CGF的實驗組命名為1CGF組,加入兩片CGF的實驗組命名為2CGF組,加入三片CGF的實驗組命名為3CGF組,另設(shè)一不加入CGF的對照組。3 CGF對HDPSCs增殖能力的影響取生長狀態(tài)良好的第4代HDPSCs,以1×104/孔細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基,實驗組分別加入含3個濃度梯度富CGF纖維蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,對照組加入不含富CGF纖維蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,以上四組分別于培養(yǎng)后1、3、5、7天棄去原培養(yǎng)液,將6孔板內(nèi)細(xì)胞消化接種于96孔板內(nèi),加入CCK-8液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育兩小時,檢測各組450nm處吸光度值。4 CGF對HDPSCs礦化能力的影響取生長狀態(tài)良好的第4代HDPSCs,以2×105/孔細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基,實驗組分別加入含3個濃度梯度富CGF纖維蛋白膜的礦化誘導(dǎo)液,對照組加入不含CGF纖維蛋白膜的礦化誘導(dǎo)液,以上四組培養(yǎng)7天、14天后,棄去原培養(yǎng)液,根據(jù)堿性磷酸酶定量試劑盒說明書測定各組堿性磷酸酶活性。5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)作單因素方差分析,用SNK法和Dunnett’s T3法做兩兩比較,實驗數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,P0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1通過酶消化法進(jìn)行HDPSCs原代培養(yǎng),鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)大體呈梭形,胞體豐滿,包漿豐富,核仁圓形或橢圓形,位于細(xì)胞中央。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD44、CD29呈陽性,CD34、CD45呈陰性,細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)四周后,茜素紅染色可見細(xì)胞內(nèi)有紅色鈣化物形成,油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴形成。2與對照組相比,實驗組各CGF濃度均對HDPSCs的增殖起促進(jìn)作用,且該促進(jìn)作用具有濃度依賴性,隨著CGF濃度的增加,其促進(jìn)作用增強。3與對照組相比,實驗組各CGF濃度均對HDPSCs的成牙本質(zhì)/成骨分化起促進(jìn)作用,且該促進(jìn)作用具有濃度依賴性,隨著CGF濃度的增加,其促進(jìn)作用增強。結(jié)論:1通過酶消化法培養(yǎng)的HDPSCs,細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn),細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞分化能力鑒定結(jié)果均符合人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性。2一定濃度范圍內(nèi)的CGF對于HDPSCs的增殖及分化可起到促進(jìn)作用,為CGF及牙髓干細(xì)胞的組織工程研究乃至臨床應(yīng)用提供了新的契機。
[Abstract]:Objective : To study the proliferation and mineralization of human dental pulp stem cells ( HDPSCs ) . The experiment group was divided into two groups : 1 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium containing 3 concentration gradient rich CGF fibrin membranes . The experimental group was divided into 2 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium . The experimental group was divided into 3 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium . Compared with the control group , the CGF concentration in the experimental group promoted the proliferation and differentiation of HDPSCs . Conclusion : The CGF in the experimental group can promote the proliferation and differentiation of HDPSCs , and provide a new opportunity for the research of the tissue engineering of CGF and dental pulp stem cells and even clinical application .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1394923