發(fā)布時間：2017-12-24 05:02

  本文關(guān)鍵詞：慢性牙周炎牙齦上皮細(xì)胞炎性復(fù)合物產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景牙周病(periodontal disease)是目前世界公認(rèn)的受局部因素和全身因素相互促進(jìn)、相互拮抗而產(chǎn)生的一類機(jī)制復(fù)雜的多因素疾病。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是其中最常見的一類,其典型癥狀表現(xiàn)為牙齦的炎癥和出血,牙周袋的形成,牙槽骨的吸收、以及最終牙齒的松動和脫落�？谇谎例l上皮作為抵御外界細(xì)菌感染的第一道屏障,維持著牙齦組織的健康和機(jī)體的平衡。健康的牙齦上皮可分為三部分：口腔上皮,齦溝上皮和結(jié)合上皮。非角化的齦溝生皮和結(jié)合上皮作為第一道屏障與齦溝內(nèi)細(xì)菌緊密接觸。牙齦的上皮細(xì)胞可以通過感受病理識別受體的刺激,釋放前炎癥因子、細(xì)胞因子和防御素,進(jìn)而破壞上皮緊密連接結(jié)構(gòu)而向深部移行形成深溝或深袋,最終形成牙周袋。這些變化通常是受感染上皮的不同細(xì)菌產(chǎn)物,特別是牙齦卟啉單胞菌的作用造成的,其內(nèi)的微生物膜釋放的細(xì)菌產(chǎn)物可以破壞宿主的免疫反應(yīng)。在眾多的多蛋白炎性復(fù)合物中，炎癥復(fù)合小體在天然免疫中占有重要作用,這類復(fù)合體由NLR家族成員組成,包括3個亞類,NODs, NLRPs, IPAP,在這幾個亞類中,NLRP3炎癥復(fù)合物是目前研究最多的一類。NLRP3炎癥復(fù)合物由NLRP3, ASC,Caspase-1組成,激活后釋放IL-1β,IL-18前炎癥因子,這是在宿主防御和感染中反應(yīng)最為明顯的兩個因子。本研究中,我們將探討牙齦上皮細(xì)胞系在不同因素刺激作用下NLRP3炎癥復(fù)合物的反應(yīng)機(jī)制及口腔牙齦上皮細(xì)胞緊密連接與炎癥反應(yīng)間的關(guān)系,進(jìn)而為有效的控制和治療牙周病提供理論依據(jù)。方法1.樣本采集：選取符合實驗條件預(yù)備拔牙的牙周病患者共26名,詳細(xì)記錄臨床及X線片資料。按照實驗要求切取牙齦組織后做冰凍切片及組織染色。2.口腔上皮細(xì)胞培養(yǎng)實驗用H413細(xì)胞系是從口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌中分離出具有復(fù)層上皮細(xì)胞形態(tài)并高表達(dá)CD24的一類細(xì)胞系�？寺〖�(xì)胞系培養(yǎng)條件是JMEM,胎牛血清和盤尼西林/鏈霉素的混合培養(yǎng)基,37℃含5%C02的孵箱。該細(xì)胞系一般3天進(jìn)行一次傳代。3.牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌ATCC33277培養(yǎng)于專用的細(xì)菌厭氧箱中,當(dāng)細(xì)菌從-80℃復(fù)蘇后接種于TSB培養(yǎng)皿上,待生成單菌株后,挑去單顆置于eTSB(含維生素K)的培養(yǎng)液中,測OD值達(dá)1.0時用于實驗。4.免疫組化染色和共聚焦激光掃描顯微術(shù)所有切片及細(xì)胞使用免疫組化染色,共聚焦激光顯微鏡(Olympus FV 10-MCPSU (405nm,473nm,633nm), NTT electronic Optiλ, (559 nm)激光)觀察并拍照,由兩個觀察員獨(dú)立觀察,標(biāo)記,分類,讀數(shù)并記錄。所有圖片用共焦采集軟件(FV10-ASW1.7)處理并保存為TIF文件。5.提取細(xì)胞RNA,轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實時定量RT-PCR:用Trizol提取法(Trizol regent, Invitrogen)提取細(xì)胞總RNA。用SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)實時定量RT-PCR測在牙齦卟啉單胞菌感染、LPS以及ATP刺激的不同時間時細(xì)胞炎癥復(fù)合物的基因表達(dá)水平以及細(xì)胞緊密連接中各種基因的表達(dá)水平的差異。6.酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1p及IL-18的表達(dá)水平：在上述處理條件中,不同時間點(0,1,2,3,4,5,6個小時)收集細(xì)胞培養(yǎng)盤中的media離心取上清按照ELISA kits (Abnova, Taiwan)設(shè)計96孔盤,分析IL-1p及IL-18的蛋白表達(dá)水平。7.免疫印跡法分析蛋白表達(dá)水平：按實驗設(shè)計處理細(xì)胞后,收集蛋白,加熱,變性,固定,加樣,跑膠,轉(zhuǎn)膜,封閉,常溫,過夜。一抗孵育4小時,二抗孵育2小時,終止反應(yīng)后觀察。8.統(tǒng)計分析：Prism 3.03軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果：1.牙周活組織檢查中NLRP3和occludin的表達(dá)分布健側(cè)和患側(cè)的齦溝上皮以及健側(cè)和患側(cè)的袋內(nèi)上皮之間NLRP3的表達(dá)有顯著性差異。健側(cè)牙齦的齦溝上皮和結(jié)合上皮與患側(cè)袋內(nèi)上皮之間occludin有顯著性差異。2.Pg、LPS、ATP+Pg、ATP+LPS作用后炎癥復(fù)合物的表達(dá)牙齦卟啉單胞菌刺激細(xì)胞抑制NLRP3炎性復(fù)合物的合成和釋放。LPS促進(jìn)NLRP3,ASC而非caspase-1的表達(dá)。ATP可以促進(jìn)NLRP3炎性復(fù)合物的釋放和IL-1β及IL-18細(xì)胞因子的生成。IL-1β在牙齦卟啉單胞菌作用下出現(xiàn)明顯表達(dá)增高,而LPS對它的作用并不明顯。相反,牙齦卟啉單胞菌感染并不能誘導(dǎo)IL-18的合成,而LPS或ATP的刺激可以誘導(dǎo)IL-18的合成和釋放。3. Pg、LPS、ATP+Pg、ATP+LPS作用后細(xì)胞緊密連接的表達(dá)牙齦卟啉單胞菌作用后,僅出現(xiàn)Claudin-4的短暫升高,而Occludin、JAM-A、 Claudin-1、Claudin-15及ZO-1均表現(xiàn)出了明顯的抑制和下調(diào)。LPS作用后,除Occludin、JAM-A、claudin-4之外,其余的蛋白均出現(xiàn)了明顯的上調(diào)。ATP作用后Occludin、JAM-A、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-15及ZO-1的表達(dá)一過性增強(qiáng)。結(jié)論：1.牙齦卟啉單胞菌完全抑制了NLRP3炎性復(fù)合物的表達(dá)過程,而且除Claudin-4外,其他發(fā)揮屏障功能的蛋白均出現(xiàn)失調(diào)狀態(tài)。這為細(xì)菌等致病因素進(jìn)一步感染細(xì)胞提供了便利。2.LPS促進(jìn)NLRP3,ASC而非caspase-1的表達(dá)增強(qiáng)。Occludin、JAM-A和claudin-4作為第一道屏障,在受到LPS的刺激時表現(xiàn)出抑制作用,提示LPS在促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程及破壞前沿細(xì)胞屏障防御系統(tǒng)中具有重要作用。3.ATP促進(jìn)NLRP3炎性復(fù)合物釋放、細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)增強(qiáng)和IL-1β及IL-18細(xì)胞因子的生成。這提示ATP在刺激細(xì)胞膜極性化并導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的破壞及細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化的過程中具有重要作用。4. Cspase-1通常以非活化的酶原狀態(tài)存在。在LPS刺激后并沒有任何反應(yīng)直到ATP活化細(xì)胞之后才釋放。說明它的激活嚴(yán)格受到炎癥復(fù)合物的調(diào)控。5.IL-1β作為天然免疫過程中最早釋放的細(xì)胞因子之一,在參與激活和免疫調(diào)節(jié)過程中具有重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4

【共引文獻(xiàn)】

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1 朱鐵錘;;NLRP3在馬兜鈴酸致腎損傷小鼠腎臟組織中的表達(dá)及其意義[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

2 曹雪嬌;侯衛(wèi)平;張媛媛;袁發(fā)煥;;P2X7/NALP3在急性腎小管壞死腎組織中的表達(dá)及意義[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2014年06期

3 馮燕，

本文編號：1326949