發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 15:17

  本文關(guān)鍵詞：DUSP1在涎腺腺樣囊性癌中的作用及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：目的涎腺腺樣囊性癌(SACC)是較常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤,具有嗜神經(jīng)侵襲并順其逐漸擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性,進(jìn)而導(dǎo)致SACC患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率均較高,預(yù)后不佳,然而目前對(duì)SACC高侵襲性及轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍缺乏認(rèn)識(shí)。雙特異性磷酸酶1(DUSP1),是一種雙向特異性蘇/酪氨酸磷酸酯酶,其可通過(guò)脫磷酸來(lái)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的活性,進(jìn)而在細(xì)胞生長(zhǎng)周期及細(xì)胞增殖等方面起到極其重要的調(diào)控作用。近年來(lái)表觀遺傳學(xué)在腫瘤研究中日益受到重視,DNA甲基化是惡性腫瘤常見(jiàn)的生物學(xué)現(xiàn)象,甲基化為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,可通過(guò)抑制甲基化基因nRNA的產(chǎn)生而使蛋白生成減少。目前在SACC中已有抑癌基因異常甲基化的相關(guān)報(bào)道,但DUSP1在SACC中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)仍未見(jiàn)報(bào)道。方法1.采用免疫組化法檢測(cè)48例SACC石蠟組織和20例癌旁石蠟組織中DUSP1表達(dá)水平,并收集臨床資料,分析DUSP1與SACC患者臨床病理特征的關(guān)系。2.采用RT-PCR法檢測(cè)32對(duì)SACC和癌旁冰凍組織中DUSP1的RNA水平。3.采用Kaplan-Meier法、Cox回歸分析法,檢驗(yàn)DUSP1表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系。4.實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測(cè)SACC癌細(xì)胞及對(duì)應(yīng)癌旁細(xì)胞中DUSP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài),并運(yùn)用不同濃度5-Aza-dc處理涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-83和SACC-LM,采用western blot檢測(cè)5-Aza-dc處理后DUSP1基因蛋白表達(dá)的改變情況。5.運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),建立DUSP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)和陰性對(duì)照細(xì)胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。6.運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell Insert細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),來(lái)測(cè)定DUSP1表達(dá)上調(diào)對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等的影響。7.采用人全基因組芯片測(cè)序法,檢測(cè)SACC-83-DUSP1和SACC-83-vector兩細(xì)胞株下游調(diào)控通路的不同。8.采用裸鼠成瘤試驗(yàn),檢測(cè)DUSP1表達(dá)上調(diào)對(duì)裸鼠涎腺腺樣囊性癌成瘤及轉(zhuǎn)移等的影響。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果示：DUSP1在20例癌旁組織中均呈陽(yáng)性表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性率100%;48例SACC組織中,18例陽(yáng)性表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性率為37.5%,將兩組表達(dá)陽(yáng)性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、局部侵犯患者的DUSP1的表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),而不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的DUSP1的表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。2. RT-PCR結(jié)果示：SACC組織中DUSP1的表達(dá)量顯著低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.單因素生存曲線(xiàn)比較(Kaplan-Meier 法)顯示：30例DUSP1陰性表達(dá)患者中,發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)者為21例(70%),18例DUSP1日性表達(dá)患者中,發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)者為4例(22.2%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028),但多因素生存分析(Cox回歸分析)顯示DUSP1表達(dá)仍不是患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。4.實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR (qMSP)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SACC癌細(xì)胞DUSP1基因啟動(dòng)子甲基化程度明顯比對(duì)應(yīng)癌旁細(xì)胞高,且運(yùn)用western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)5-Aza-dc處理后,SACC-83和SACC-LM細(xì)胞中DUSP1蛋白的表達(dá)水平顯著提高。5. DUSP1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染SACC-83、SACC-LM細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞株的DUSP1蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào),成功建立了DUSP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)和陰性對(duì)照細(xì)胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。6.克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell Insert細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：DUSP1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株(SACC-83-DUSP1, SACC-LM-DUSP1)的克隆形成能力、侵襲力、遷移能力和細(xì)胞增殖能力均弱于陰性對(duì)照細(xì)胞株(SACC-83-vector, SACC-LM-vector)。7.全基因組芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：在GO功能富集分析中,過(guò)表達(dá)DUSP1后SACC-83細(xì)胞中差異表達(dá)基因主要富集于olfactory transduction, metabolic pathways以及neuroactive ligand-receptor interaction等重要過(guò)程；KEGG通路富集分析結(jié)果提示過(guò)表達(dá)DUSP1影響到cytoskeleton、positive regulation of gene expression和integrin-mediated signaling pathway等多條信號(hào)通路的激活。8.裸鼠成瘤試驗(yàn)結(jié)果示：SACC-83-DUSP1組10只裸鼠中3只成瘤、但均未發(fā)生轉(zhuǎn)移；SACC-83-Vector組10只裸鼠中10只裸鼠均成瘤,且發(fā)生轉(zhuǎn)移。結(jié)論DUSP1在SACC中表達(dá)明顯低于癌旁組織,DUSP1低表達(dá)與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、局部侵犯和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)；SACC組織中發(fā)現(xiàn)DUSP1基因啟動(dòng)子存在高水平甲基化,且SACC中DUSP1表達(dá)水平與DUSP1啟動(dòng)子甲基化呈明顯負(fù)相關(guān)；DUSP1表達(dá)上調(diào)可使SACC細(xì)胞的克隆形成能力、侵襲力、劃痕愈合能力和細(xì)胞增殖能力,以及裸鼠成瘤及轉(zhuǎn)移能力明顯減弱,且與多條信號(hào)調(diào)控通路密切相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明DUSP1在SACC中起到了一個(gè)抑癌基因的角色,DUSP1表達(dá)上調(diào)可明顯抑制SACC的發(fā)生發(fā)展,有望成為SACC預(yù)后評(píng)價(jià)、臨床診斷及治療的有效生物標(biāo)記物。
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王佳峰;葛明華;王可敬;譚卓;陳超;徐加杰;;小涎腺腺樣囊性癌52例臨床分析[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2012年12期

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本文編號(hào)：1288371