本文關(guān)鍵詞：一個(gè)遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型家系致病基因鑒定及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：背景與目的牙齒的缺陷是人類疾病的一個(gè)重要部分,牙齒發(fā)育是生物整體發(fā)育中一個(gè)很重要的事件。根據(jù)目前的研究進(jìn)展,遺傳性牙本質(zhì)缺陷分為5種類型：遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全分為3種類型,遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良分2種類型。遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅰ型是成骨發(fā)育不全癥伴隨牙本質(zhì)發(fā)育不全。遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅱ型,遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅱ型以及遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅲ型的致病基因?yàn)榫幋a主要的非膠原蛋白基因DSPP且遺傳缺陷方式僅限于牙齒。遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良(dentin dysplasia)是一種常染色體顯性遺傳病,分為Ⅰ,Ⅱ兩個(gè)亞型,Ⅰ型牙本質(zhì)發(fā)育不良的發(fā)病率為十萬(wàn)分之一,屬于罕見(jiàn)病,而且致病基因并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)[1]。遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型主要臨床表現(xiàn)為牙髓腔閉塞,牙根短小,我們通過(guò)一個(gè)包含有14個(gè)病人的中國(guó)大家系的連鎖分析將DDI致病基因定位在3p26.2-3p24.3,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的篩查和測(cè)序,在3p26.1確定致病基因ssuh2的一個(gè)錯(cuò)義突變c.353CA(P118Q),此突變?cè)谶z傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型家系中出現(xiàn)遺傳共分離。緊接著我們對(duì)ssuh2在家系成員體內(nèi)的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了研究,同時(shí)對(duì)體外細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行研究及蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。本課題組發(fā)現(xiàn)的遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型(DD-I)致病基因ssuh2在牙齒發(fā)育中的作用與功能還需要更進(jìn)一步的探索。由于斑馬魚和小鼠的牙齒都有牙髓腔、牙本質(zhì)和類牙釉質(zhì),在牙齒附著期間存在釉器,也有類似于人類牙齒的發(fā)育期,即蕾狀期、帽狀期、鐘狀期,只是相對(duì)簡(jiǎn)單且周期很短,和人類以及其它哺乳動(dòng)物的牙齒有很多相似點(diǎn),而且斑馬魚與小鼠還具有繁殖周期短,實(shí)驗(yàn)數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn),因此,斑馬魚和小鼠能夠作為牙齒發(fā)育研究的模式生物。斑馬魚中調(diào)控牙齒發(fā)育的基因有BMPs、FGF、Alk8、Pitx2a、Dlx、Pax9,它們?cè)谌祟愔卸加邢鄳?yīng)的同源基因。在本課題組的前期研究中,我們確定了ssuh2基因在斑馬魚中的同源基因zgc：153440在斑馬魚中的表達(dá)及功能。因此,我們通過(guò)嗎啉修飾的反義寡核苷酸(MO)降低ssuh2基因在斑馬魚中的同源基因表達(dá)的方法來(lái)研究它在牙齒發(fā)育中對(duì)其它基因的影響,實(shí)現(xiàn)在斑馬魚中研究牙齒發(fā)育相關(guān)基因的完整路線,同時(shí)確定人類ssuh2基因與牙齒發(fā)育的相關(guān)性。由于基因敲除技術(shù)抑制基因的表達(dá),降低甚至是消除某個(gè)基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá),然后從形態(tài)、組織以及分子等水平來(lái)研究它對(duì)生物的影響,可以了解它的功能。我們對(duì)ssuh2基因在小鼠中的同源基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)分析以及該基因在小鼠各個(gè)器官的表達(dá)水平分析。隨后,我們通過(guò)kncok-in技術(shù)構(gòu)建了基因缺陷小鼠,通過(guò)普通PCR擴(kuò)增技術(shù)和Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因缺陷小鼠的基因型鑒定。根據(jù)ssuh2基因在小鼠中的同源基因的表達(dá)譜,我們選取不同基因型(野生型,雜合突變,純合突變)出生后15天(P15)小鼠的下頜組織進(jìn)行表達(dá)量的分析以及出生后三個(gè)月(d90)小鼠下頜組織形態(tài)的分析。因此,本課題以斑馬魚和基因缺陷小鼠作為動(dòng)物模型,采用“敲低表達(dá)”的方法實(shí)現(xiàn)模式動(dòng)物的構(gòu)建,通過(guò)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)手段,初步研究了ssuh2基因在斑馬魚牙齒發(fā)育過(guò)程中對(duì)其他基因的影響以及ssuh2基因缺陷小鼠的表型鑒定。材料與方法1.家系標(biāo)本采集和臨床資料采集：采取大家系中每個(gè)成員的外周血,提取DNA和RNA；收集患者的臨床病歷資料。2.連鎖分析：利用基于SNP的連鎖分析確定致病基因所在區(qū)域,并通過(guò)微衛(wèi)星定位進(jìn)行驗(yàn)證。3.目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序篩查SNP位點(diǎn),對(duì)于篩查到的SNP進(jìn)行驗(yàn)證及家系共分離實(shí)驗(yàn),最后確定致病基因ssuh2。4.使用高分辨率熔煉曲線(High Resolution Melting, HRM)技術(shù)篩查當(dāng)?shù)厝巳?000份隨機(jī)樣本,確定ssuh2基因c.353CA(P118Q)的突變頻率。5.ssuh2的生物信息分析：通過(guò)SOSUI對(duì)ssuh2進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用I-TASSER預(yù)測(cè)ssuh2的三位蛋白結(jié)構(gòu)；通過(guò)PolyPhen2預(yù)測(cè)突變P118Q的功能改變。6.通過(guò)提取家系成員的外周血RNA,對(duì)基因ssuh2進(jìn)行體內(nèi)mRNA表達(dá)水平分析7. ssuh2蛋白的亞細(xì)胞定位：將人類ssuh2基因正常轉(zhuǎn)錄本與異常轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆到載體pEGFP-C1上利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明轉(zhuǎn)染到已培養(yǎng)好的COS7細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用DAPI染核技術(shù)染核,于熒光顯微鏡下觀察拍照,比較野生型蛋白與突變型蛋白在細(xì)胞中表達(dá)部位的差異。。8.在體外對(duì)ssuh2進(jìn)行mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平研究。9.利用NCBI的BLAST在線比對(duì)軟件,搜尋人類Bmp2a,Pitx2,Pax9在斑馬魚中的同源基因,對(duì)它們的相似性進(jìn)行分析。通過(guò)Primer3軟件對(duì)斑馬魚中的同源基因設(shè)計(jì)引物,用于擴(kuò)增相應(yīng)基因的mRNA的CDS區(qū)。10. 將牙齒發(fā)育相關(guān)基因的CDS區(qū)克隆到載體pBSK上,然后用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成該同源基因的反義RNA探針。11. 通過(guò)顯微注射將morpholino導(dǎo)入斑馬魚的受精卵,使用整體原位雜交技術(shù)分析斑馬魚相關(guān)基因在ssuh2基因表達(dá)降低時(shí)的影響。12.通過(guò)NCBI軟件找出ssuh2基因在小鼠中的同源基因,并用Primer3在線軟件設(shè)計(jì)引物,在RNA水平構(gòu)建小鼠ssuh2同源基因的表達(dá)譜。13.取正常C57BL/6小鼠不同器官包括心,肝,脾,肺,腎,腦,下頜,小腸等組織,利用液氮研磨,TRIZOL提取組織RNA,然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模版進(jìn)行PCR,觀察ssuh2基因在小鼠不同器官中的表達(dá)。14.取不同時(shí)期正常C57BL/6小鼠的下頜,包括E1,E3,E5,E7,E11,P3,P7,P15利用液氮研磨,TRIZOL提取組織RNA,構(gòu)建ssuh2基因在小鼠中的時(shí)空表達(dá)譜。15.通過(guò)knock-in技術(shù)產(chǎn)生基因缺陷小鼠,經(jīng)過(guò)交配產(chǎn)生不同基因型(正常,雜合,純合)小鼠。16.對(duì)小鼠進(jìn)行剪腳趾編號(hào)并用堿裂解法對(duì)剪下的腳趾提取DNA, PCR后產(chǎn)物用Sanger測(cè)序確定小鼠基因型。17.取三個(gè)月大不同基因型小鼠的下頜,經(jīng)過(guò)固定,脫水,包埋等步驟后進(jìn)行石蠟切片,切片厚度為0.2μmm。切片完成后,經(jīng)過(guò)脫蠟,復(fù)水等一系列步驟后對(duì)片子進(jìn)行HE染色,染色完成后干燥封片,并用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。18.取三個(gè)月大不同基因型小鼠下頜固定,接著用顯微-CT掃描并進(jìn)行三維合成圖片,比較不同基因型樣本之間的差異。19.取三個(gè)月大不同基因型小鼠下頜固定,接著進(jìn)行梯度脫水,然后浸泡在不同梯度的樹(shù)脂中,最后包埋在樹(shù)脂中進(jìn)行打磨。將打磨好的樣本噴金,然后通過(guò)掃描電子顯微鏡拍照,比較不同基因型樣本之間的差異。20.取出生后3天C57BL/6小鼠的下頜,利用液氮研磨,TRIZOL提取組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。比較不同基因型小鼠ssuh2基因的同源基因RNA水平表達(dá)量的不同,并比較與牙齒發(fā)育相關(guān)基因在不同基因型小鼠中的表達(dá)量。結(jié)果通過(guò)基于SNP的連鎖分析技術(shù)以及微衛(wèi)星精確定位,將致病基因的候選區(qū)域定位在3p26.1-3p24.3(chr3:6,732,117-18,359,306),結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序法篩查SNP及家系共分離確定致病基因ssuh2,通過(guò)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)ssuh2突變c.353CA(P118Q),通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),家系中患者外周血中的mRNA表達(dá)水平低于正常人。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),突變后的蛋白亞細(xì)胞定位并沒(méi)有發(fā)生改變,但是mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)均低于正常水平。提取斑馬魚56hpf的總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA做模板進(jìn)行普通PCR,確定牙齒發(fā)育相關(guān)基因在此時(shí)間段表達(dá),結(jié)果顯示：Bmp2a, Pitx2,Pax9在斑馬魚胚胎發(fā)育早期有表達(dá)；為了確定它們?cè)谂咛ブ械氖欠袷躶suh2基因的影響,進(jìn)行了這個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎整體原位雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示：Bmp2a,Pitx2,Pax9主要集中在斑馬魚腮弓處表達(dá),ssuh2基因通過(guò)morpholino降低表達(dá)后,與牙齒發(fā)育相關(guān)基因Bmp2a,Pitx2,Pax9表達(dá)量均表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)。首先確定ssuh2在小鼠中的時(shí)空表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)ssuh2在小鼠體內(nèi)廣泛表達(dá),在胚胎發(fā)育時(shí)期和牙齒發(fā)育時(shí)期表達(dá)隨時(shí)間推移增高,但是在小鼠牙齒發(fā)育完成后表達(dá)降低。通過(guò)小鼠剪腳趾提取DNA后鑒定,確定基因缺陷小鼠的ssuh2基因發(fā)生突變,取出生后15天小鼠下頜提取RNA,比較不同基因型小鼠ssuh2基因的表達(dá)差異,結(jié)果顯示：雜合子與純合子小鼠ssuh2基因的表達(dá)量均比正常小鼠低,并且存在劑量效應(yīng)；取一月齡不同基因型小鼠下頜,進(jìn)行HE染色,結(jié)果顯示：野生型小鼠有較寬的前牙本質(zhì)區(qū),雜合子小鼠的前牙本質(zhì)區(qū)變窄,純合子小鼠的前牙本質(zhì)區(qū)基本消失；取三月齡不同基因型小鼠的下頜,經(jīng)過(guò)顯微CT掃描,三維合成后結(jié)果顯示：雜合子和純合子小鼠相比于野生型小鼠的牙髓腔都有相應(yīng)的減�。蝗∫辉慢g不同基因型小鼠的下頜,經(jīng)過(guò)電子掃描顯微鏡觀察,結(jié)果顯示：野生型小鼠的牙本質(zhì)小管排列緊密,雜合型小鼠的牙本質(zhì)小管減少,純合子小鼠的牙本質(zhì)小管比雜合小鼠的牙本質(zhì)小管更少。結(jié)論根據(jù)本課題組的研究,通過(guò)連鎖分析技術(shù)以及微衛(wèi)星定位,將致病基因的候選區(qū)域定位在3p26.1-3p24.3(chr3:6,732,117-18,359,306),結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序法篩查SNP及家系共分離確定致病基因ssuh2,通過(guò)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)ssuh2突變c.353CA(P118Q),通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),家系中患者外周血中的nRNA表達(dá)水平低于正常人。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),突變后的蛋白亞細(xì)胞定位并沒(méi)有發(fā)生改變,但是mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)均低于正常水平。發(fā)現(xiàn)斑馬魚中ssuh2同源基因缺陷可以導(dǎo)致斑馬魚牙齒發(fā)育缺陷。通過(guò)morpholino降低斑馬魚中ssuh2同源基因的表達(dá),運(yùn)用整體原位雜交技術(shù)確定ssuh2斑馬魚同源基因的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其它與牙齒發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)改變：Bmp2a, Pitx2, Pax9表達(dá)量在斑馬魚牙齒早期發(fā)育均表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)。利用普通PCR相對(duì)定量證實(shí)ssuh2在小鼠中的同源基因在小鼠胚胎發(fā)育期和出生后前期發(fā)育均有表達(dá),且在胚胎發(fā)育期ssuh2隨發(fā)育時(shí)間增加表達(dá)上升。在出生后7天表達(dá)量達(dá)到高峰,而成年小鼠幾乎不表達(dá)；取出生后15天小鼠的各個(gè)器官,提取RNA,研究ssuh2基因在小鼠中的表達(dá)譜。ssuh2基因在小鼠的大部分器官中均表達(dá),但在舌頭,下頜,腦以及小腸表達(dá)量較高。通過(guò)knock-in技術(shù)構(gòu)建ssuh2基因缺陷小鼠,提取出生后3天小鼠的下頜RNA,通過(guò)RT-RCR技術(shù)確定雜合子小鼠ssuh2基因的表達(dá)量比野生型小鼠ssuh2基因的表達(dá)量低,而純合子小鼠ssuh2基因的表達(dá)量比雜合子ssuh2基因的表達(dá)量低,說(shuō)明ssuh2基因存在劑量效應(yīng)導(dǎo)致牙齒缺陷。通過(guò)Micro-CT和電子掃描顯微鏡技術(shù)對(duì)不同基因型小鼠下頜進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)ssuh2基因缺陷存在劑量效應(yīng),基因缺陷小鼠的牙齒比正�；蛐托∈笱例X的牙髓腔小,牙本質(zhì)小管也減少。通過(guò)石蠟切片,HE染色,觀察小鼠牙齒的病理形態(tài),基因缺陷小鼠的前牙本質(zhì)區(qū)減少。通過(guò)RT-PCR技術(shù),確定小鼠ssuh2同源基因缺陷可以導(dǎo)致小鼠牙齒發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)改變,包括DSPP, PAX9, Bmp2, Bmp4, Runx2, DMP1,由此可以看出基因缺陷小鼠牙齒存在缺陷,牙釉質(zhì)發(fā)育異常,牙髓腔減小,牙本質(zhì)小管減少,前牙本質(zhì)區(qū)減少,這些缺陷與DD-Ⅰ病人表型相似。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.9

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 杜偉;陳放;解正高;;ABCB6基因在一常染色體顯性遺傳脈絡(luò)膜缺損家系中的突變篩查(英文)[J];國(guó)際眼科雜志;2014年12期

2 趙牧;王宇;馮馳;;翼狀胬肉cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及序列分析[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年12期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 李端琢;ABCB6突變導(dǎo)致遺傳性泛發(fā)型色素異常[D];華中科技大學(xué);2013年

2 李端琢;ABCB6突變導(dǎo)致遺傳性泛發(fā)型色素異常[D];華中科技大學(xué);2013年

3 劉彥慧;兩個(gè)遺傳病家系的臨床和分子病理學(xué)分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王娜;泛發(fā)性色素異常癥致病基因的分離與功能分析[D];濟(jì)南大學(xué);2013年

2 吳秋月;兩種遺傳性色素異�；颊吲R床及分子遺傳學(xué)研究[D];南京師范大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1258630