本文關(guān)鍵詞：Gli1在人牙周膜干細胞應(yīng)力成骨過程中的調(diào)控作用

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【摘要】：正畸治療過程中牙位移動的原理是:持久的矯治力作用在牙齒上,牙齒周圍的骨組織發(fā)生改建,從而引導(dǎo)牙齒的移動,是建立在牙周組織受力后發(fā)生的生物學(xué)改建基礎(chǔ)上,包括牙齒及其周圍的附著結(jié)構(gòu)如牙骨質(zhì)、牙周膜及牙槽骨的移動改建。但牙的移動并不是簡單的機械移位,在整個過程中,成骨細胞和破骨細胞的共同參與,相互協(xié)調(diào)使牙槽骨發(fā)生選擇性吸收和形成即在壓力側(cè)發(fā)生骨的吸收,張力側(cè)有新骨的形成。而牙槽骨的改建由牙周膜介導(dǎo),因此牙齒移動首先表現(xiàn)為牙周膜現(xiàn)象。在牙周膜中存在一種有多向分化,自我更新,克隆形成能力的干細胞,即人牙周膜干細胞(PDLSCs),它為牙周組織包括牙槽骨的再生提供新的細胞來源。研究表明,牙周膜干細胞在應(yīng)力作用下可分化為成骨細胞和軟骨細胞,在牙槽骨改建的起著關(guān)鍵作用。干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化并不是一個單一的過程,而是由眾多生長因子和通路共同作用的結(jié)果。但其具體機制目前還不十分清楚。Hedgehog信號參與了胚胎發(fā)育期間各種組織器官的形成,特別是在骨的生長發(fā)育過程中起了重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,Hedgehog信號途徑介導(dǎo)了間充質(zhì)干細胞(MSCs)向成骨,軟骨細胞轉(zhuǎn)化和軟骨骨化的一系列過程。多種因素可直接或間接通過調(diào)控Hh信號通路從而使間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。本課題組前期證實了周期性張應(yīng)力可促進PDLSCs向成骨細胞分化,并證實了Hh信號通路參與了PDLSCs應(yīng)力成骨過程。Glil(Gliloma-associated oncogene homoglog)是Hh信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,是該通路激活的最重要標志,其如何通過調(diào)控Hh信號通路來影響PDLSCs成骨的分子機制還少有研究。因此,本實驗擬構(gòu)建過表達Glil基因腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染PDLSCs細胞,探討上調(diào)Glil基因?qū)DLSCs增殖及其在應(yīng)力作用下成骨分化的影響,為進一步了解在應(yīng)力作用下牙齒生理性移位時牙槽骨的改建機制而打下一定的實驗基礎(chǔ)。目的通過體外構(gòu)建Glil基因腺病毒載體,以此上調(diào)人牙周膜干細胞(PDLSCs)中Glil基因的表達,從而探討其對人PDLSCs增殖及應(yīng)力成骨分化的影響方法:1人牙周膜干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定牙齒標本是來自于在臨床上因矯正需要而拔除的牙周健康的新鮮前磨牙(年齡在12~24歲之間),并經(jīng)患者及其家屬知情同意。用含1%雙抗的pbs反復(fù)沖洗牙齒后,在牙根中1/3部位單向刮取牙周膜組織,用酶消化聯(lián)合組織塊法進行原代培養(yǎng)。將用i型膠原酶消化45分鐘后的組織混懸液離心后接種于六孔板內(nèi),二天后第一次換液,之后每3天換液,收集獲得牙周膜細胞,用流式細胞分選術(shù)得到pdlscs。在鏡下通過觀察細胞形態(tài)和它的克隆形成能力、采用流式細胞術(shù)分析其細胞表面標志物cd146、免疫組化法檢測波形蛋白和角蛋白的表達以及對其進行成骨成脂誘導(dǎo)分化實驗來鑒定其干細胞特性。3腺病毒轉(zhuǎn)染用攜帶gli1特異性過表達的腺病毒感染pdlscs,westernblot檢測pdlscs中g(shù)li1的表達情況。實驗分為三組:即正常細胞對照組pdlscs/正常組、空腺病毒感染的pdlscs/空載組和由攜帶gli1特異性過表達腺病毒感染的pdlscs/gli1過表達組。4細胞應(yīng)力加載分別取上述第4~6代三組細胞,接種于bioflex專用的板底為硅膠模的六孔板內(nèi)培養(yǎng)。使用fx-4000t加載系統(tǒng)(達到國際標準化水平)以最大形變量12%,最小形變量為0的正弦波對三組細胞進行動態(tài)張應(yīng)力的加載,頻率為0.1hz(即5s拉伸5s放松),設(shè)定作用時間為0h(在同等條件下靜置培養(yǎng))、6h、12h、24h。收集細胞,提取蛋白,westernblot檢測hh信號通路的相關(guān)效應(yīng)蛋白gli1、ptch1和pdlscs成骨相關(guān)標志物runx2、alp的表達改變。結(jié)果:1、原代培養(yǎng)出的牙周膜細胞,鏡下呈三角形或長梭形,梭形兩端有的有突起和分叉,可與鄰近細胞突起連接;通過流式細胞術(shù)分選所得pdlscs陽性率為94.8%(細胞抗體為cd146)。分選所得的pdlscs具有克隆形成能力;經(jīng)免疫組化檢測顯示角蛋白表達陰性,波形蛋白陽性,表明其來源為間充質(zhì)。pdlscs成脂誘導(dǎo)3周后,胞漿內(nèi)可見脂滴,油紅o染色陽性,成骨誘導(dǎo)3周后,鏡下可見散在礦化結(jié)節(jié),茜素紅染色陽性,說明所得的pdlscs具有成骨、成脂等多向分化能力。2、westernblot檢測轉(zhuǎn)染過表達gli1腺病毒后的pdlscs中基因的gli1的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染48h后,gli1蛋白的表達量增加[灰度值(0.041±0.024)和(0.148±0.017),p0.05],說明腺病毒載體能夠有效的上調(diào)目的蛋白gli1的表達。3、對三組pdlscs進行同一加載方式和不同加載時間的應(yīng)力加載后,提取蛋白,westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果如下:(1)pdlscs/正常組加力后成骨相關(guān)標志物runx2和alp的表達較未加力時升高,說明在應(yīng)力刺激下PDLSCs成骨分化的能力增強。(2)PDLSCs/正常組加力后檢測Hh通路中的Ptch蛋白、下游的Gli1因子及ALP和Runx2的表達水平都比未加力時升高,并隨著時間延長有所增加,說明Hh信號通路參與了PDLSCs應(yīng)力成骨過程。(3)PDLSCs/正常組、PDLSCs/空載組和PDLSCs/Gli1過表達組加力后,Ptch、Gli1、Runx2和ALP的表達水平隨著時間延長先升高后有所降低,只是增加的程度不同,在加力時間相同情況下,PDLSCs/Gli1過表達組Runx2和ALP的表達水平比PDLSCs/正常組明顯,這表明Gli1具有促進PDLSCs應(yīng)力成骨分化作用。結(jié)論:1:運用本課題組前期分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來的人牙周膜干細胞被證實有克隆形成能力,高表達干細胞表面標志物,在特定誘導(dǎo)環(huán)境下具有多向分化潛能。證明此方法(酶消化聯(lián)合組織塊法)是有效可行的。2.過表達Gli1腺病毒感染PDLSCs后,減慢了PDLSCs增殖速率,而Gli1基因可以呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達。3:細胞應(yīng)力加載后的相關(guān)檢測結(jié)果說明:PDLSCs的成骨能力隨著加力時間增加先升高后有所降低。這表明PDLSCs在后期干性減弱甚至消失。特異性過表達Gli1的PDLSCs具有更強的成骨能力,證實了Gli1激活了Hh信號通路并對PDLSCs的成骨過程具有直接的調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 朱文俊;譚媛元;梁敏;;人CD146+牙周膜干細胞的分選及其干細胞特性的鑒定[J];中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

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本文編號：1251084