研究背景及目的正畸治療過程中,外力通過矯治器作用于牙齒,傳遞至牙周膜,引起牙周組織、牙槽骨的生物力學(xué)反應(yīng),最終移動(dòng)牙齒而達(dá)到矯正的目的。力學(xué)刺激由牙齒傳遞到牙周組織,牙周膜發(fā)揮了重要的橋梁作用。牙周膜是位于牙根和牙槽骨之間的一層質(zhì)地緊密的結(jié)締組織膜,由細(xì)胞和基質(zhì)纖維構(gòu)成。作用到牙齒上的力刺激經(jīng)牙周膜進(jìn)一步傳遞至牙根周圍的牙槽骨。牙周組織改建成功與否關(guān)鍵在于牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligaments stem cells, PDLSCs),它既是正畸矯治力的直接感應(yīng)細(xì)胞,能將機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)外的生物化學(xué)信號；又是正畸力的效應(yīng)細(xì)胞,在外力作用下可分泌并釋放多種細(xì)胞因子及生長因子,還可能同時(shí)參與骨吸收和骨形成過程。有研究表明,PDLSCs含有具備分化潛能的成纖維細(xì)胞群,正畸機(jī)械作用力可誘導(dǎo)PDLSCs向成骨細(xì)胞向分化,進(jìn)一步參與骨形成與骨吸收,這是正畸牙槽骨改建重塑的關(guān)鍵所在。當(dāng)PDLSCs受到力學(xué)刺激后,機(jī)械和物理信號轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)生化信號的分子機(jī)制是十分復(fù)雜的,包括多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如,一氧化氮(NO)、骨形成蛋白2(BMP2)、轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1)、前列腺素12(PGl2)、前列腺素E2 (PGE2)、動(dòng)力敏感鈣離子通道等。近來也有研究表明細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的相關(guān)骨形成轉(zhuǎn)錄因子也參與了這一復(fù)雜的調(diào)控途徑。我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了轉(zhuǎn)錄激活因子4(Activating transcription factor-4, ATF4)參與了正畸牙齒移動(dòng)這一過程,在施加正畸力后ATF4的表達(dá)上調(diào),過表達(dá)ATF4后成骨相關(guān)因子表達(dá)量也升高,進(jìn)一步促進(jìn)PDLSCs成骨分化。ATF4是cAMP反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,它能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨形成,而蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase, PERK)在ATF4的上游發(fā)揮作用。PERK是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白,它的結(jié)構(gòu)包括信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域,其N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),C端位于胞漿側(cè)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)一種很重要的細(xì)胞器,是蛋白質(zhì)翻譯合成和儲(chǔ)存鈣離子的場所。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、鈣離子平衡失調(diào)等刺激時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一些未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積,內(nèi)環(huán)境的Ca++濃度改變,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡,此時(shí)相應(yīng)的信號通路將激活,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)。 ERS主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種蛋白-PERK, ATF6,肌醇酶1 (inositol requiring enzym E1, Ire1)介導(dǎo),其中PERK的激活處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的中心地位,作用涉及PERK-eIF2a-ATF4信號通路。在ERS條件下,PERK被激活,導(dǎo)致真核細(xì)胞起始因子2a (Eukaryotic initiation factor 2a, eIF2α)磷酸化,進(jìn)而減弱下游的因子的翻譯表達(dá)來抑制蛋白質(zhì)的合成。但與其他因子不同的是,ATF4能夠“躲避”eIF2α磷酸化的作用,在eIF2α磷酸化的情況下能夠上調(diào)ATF4,產(chǎn)生一系列效應(yīng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在心血管、腎臟等組織器官內(nèi)以及軟骨細(xì)胞增殖分化過程中,力學(xué)刺激上調(diào)ATF4表達(dá)涉及PERK,也有研究表明PERK-eIF2a-ATF4信號通路介導(dǎo)的ERS參與成骨細(xì)胞的成骨向分化；正畸牙移動(dòng)有賴于力刺激下牙周組織和骨組織的改建,其中成骨細(xì)胞在骨形成和破骨細(xì)胞附著分化方面有重要作用,受力PDLSCs的PERK、ATF4表達(dá)上調(diào),而二者均與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化折疊有關(guān),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的重要信號分子。由此推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路可能參與正畸加力時(shí)牙周組織改建過程,并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。但關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在正畸牙齒移動(dòng)中牙周膜干細(xì)胞成骨分化的作用國內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究通過人牙周膜干細(xì)胞的原代培養(yǎng),構(gòu)建牙周膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型,并檢測不同加力時(shí)間點(diǎn)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子和成骨相關(guān)基因的表達(dá)的水平變化,并在此基礎(chǔ)上,采用慢病毒質(zhì)粒包裝構(gòu)建過表達(dá)、沉默表達(dá)PERK的穩(wěn)定細(xì)胞系,對正常牙周膜干細(xì)胞和病毒轉(zhuǎn)染的牙周膜干細(xì)胞實(shí)施應(yīng)力刺激,研究ERS介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化過程中的作用。本課題試圖闡明力學(xué)因素下PERK-eIF2a-ATF4信號通路在調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的作用,為臨床矯治提供理論依據(jù),為進(jìn)一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物學(xué)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù),提高矯治效果提供新的思路和方向。研究方法1.人牙周膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定采用傳統(tǒng)的組織塊法分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞,從而獲得原代人牙周膜干細(xì)胞。傳代后對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),繪制生長曲線。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.觀察牽張力加載下人牙周膜干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子及成骨相關(guān)因子的表達(dá)變化選擇第4-6代生長旺盛,性質(zhì)穩(wěn)定的人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以2.5×105/孔的密度接種于BioFlex彈性膜六孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)24小時(shí)后換用含2%胎牛血清的條件培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后將培養(yǎng)板置于多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)中,對細(xì)胞施加振幅10%,頻率0.5HZ的周期性牽張力,加力作用時(shí)間為1h,3h,6h,12h,18h,24h。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),提取總RNA和核蛋白,采用熒光定量PCR和Western Blot測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip, Xbp1, PERK, eIFα, p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因ATF4, OCN, BSP的表達(dá)變化。3.分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細(xì)胞成骨分化中的作用利用上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成并進(jìn)行慢病毒包裝獲得過表達(dá)PERK基因的慢病毒,干擾PERK基因的慢病毒以及陰性對照的慢病毒。對人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建過表達(dá)和沉默PERK的牙周膜干細(xì)胞模型,隨后進(jìn)行靶細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)以及病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值得摸索,利用最佳MOI值對靶細(xì)胞進(jìn)行感染,通過熒光定量PCR以及Western Blot證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾PERK的牙周膜干細(xì)胞內(nèi)PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素紅染色來評價(jià)基質(zhì)礦化的程度,同時(shí)對感染病毒的細(xì)胞也進(jìn)行了牽張力的加載,拉伸強(qiáng)度10%,頻率0.5HZ,加力12h。采用熒光定量PCR和Western Blot檢測p-eIF2α和成骨相關(guān)基因-ATF4, OCN和BSP的表達(dá)水平來進(jìn)一步分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牙周膜干細(xì)胞成骨分化中的作用。結(jié)果1.采用組織塊法成功分離培養(yǎng)了原代的人牙周膜干細(xì)胞,傳代后牙周膜干細(xì)胞生長旺盛,狀態(tài)良好,形態(tài)上具備成纖維細(xì)胞的特性,約傳代后2-3天開始指數(shù)增長,8天達(dá)到峰值。人牙周膜干細(xì)胞通過染色發(fā)現(xiàn)波形絲蛋白陽性,角蛋白染色陰性證明其為來源于間充質(zhì)的細(xì)胞群,并通過成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)表明人牙周膜干細(xì)胞具有多向分化能力。2.人牙周膜干細(xì)胞在牽張力作用下形態(tài)發(fā)生一些變化,細(xì)胞明顯被拉伸,在培養(yǎng)板上逐漸呈方向性生長。細(xì)胞加力后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip,Xbpl,PERK, eIF2α, p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因(ATF4,OCN, BSP)的表達(dá)均發(fā)生了一些變化。Bip在加力后6h之內(nèi)變化不明顯,12h-24h后表達(dá)量逐漸增加；Xbp1的變化略有一些波動(dòng),在加力3h和6h后表達(dá)略有下降,但12h后表達(dá)又開始上升。PERK表達(dá)量在加力后逐漸增加,加力3h和6h時(shí)表達(dá)達(dá)一個(gè)峰值,隨后隨時(shí)間延長逐漸恢復(fù)到一個(gè)穩(wěn)定的水平；p-eIF2α的表達(dá)在加力早期升高不明顯,隨加力時(shí)間增加而表達(dá)量升高,6h達(dá)峰值,而eIF2α基本沒變化。另一方面,成骨相關(guān)基因-ATF4,骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表達(dá)水平基本上隨加力時(shí)間延長而升高。ATF4在加力早期1h后就急劇升高并達(dá)到峰值,3h和6h時(shí)有所下降,后隨加力時(shí)間逐漸升高；OCN和BSP變化比較有規(guī)律,隨加力時(shí)間延長而表達(dá)量逐漸增加。結(jié)果證實(shí)了周期性張應(yīng)力可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)以及牙周膜干細(xì)胞相關(guān)成骨基因的表達(dá)。3.采用慢病毒對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理,熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染后72h后病毒轉(zhuǎn)染效率最高。熒光定量PCR以及Western Blot證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞在過表達(dá)PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到顯著的提高,而在PERK干擾后PERKR的mRNA和蛋白水平顯著下降,并且單獨(dú)轉(zhuǎn)染陰性載體的牙周膜干細(xì)胞與正常牙周膜干細(xì)胞無明顯差異,慢病毒轉(zhuǎn)染成功。茜素紅染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了PERK過表達(dá)的牙周膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結(jié)節(jié),說明PERK的過表達(dá)促進(jìn)了牙周膜干細(xì)胞的成骨分化；而PERK干擾的牙周膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)3周后幾乎看不到鈣結(jié)節(jié),說明PERK干擾抑制了牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。通過熒光定量PCR和Western Blot對牙周膜干細(xì)胞內(nèi)相關(guān)成骨基因的水平進(jìn)行測定,證實(shí)了PERK過表達(dá)可以有效促進(jìn)p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達(dá),牽張力刺激增加這一效應(yīng),而PERK抑制減少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達(dá),在牽張力刺激下,對p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達(dá)有所升高但不如PERK過表達(dá)組和PERK過表達(dá)同時(shí)加力組。結(jié)論1.牽張力刺激促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip, Xbp1, PERK, p-eIF2a)及成骨相關(guān)基因(ATF4, OCN, BSP)的表達(dá)變化,牽張力刺激可以在一定程度上誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,從而進(jìn)一步激活PERK-eIF2a-ATF4信號通路。2. PERK過表達(dá)可以促進(jìn)鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度,進(jìn)而促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化；而PERK干擾則減少鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度,抑制牙周膜干細(xì)胞成骨分化。3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細(xì)胞成骨分化的過程。PERK過表達(dá)可以有效促進(jìn)p-eIF2P, ATF4, OCN和BSP的表達(dá),牽張力刺激增加這一效應(yīng),牽張力刺激和PERK過表達(dá)對牙周膜干細(xì)胞成骨基因表達(dá)有協(xié)同作用；而PERK抑制減少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達(dá)。意義和創(chuàng)新點(diǎn)本課題首次研究了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的作用,提出了周期性牽張力作為一種應(yīng)激刺激可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；并建立了體外加力刺激模型,更好的模擬了體內(nèi)受力環(huán)境和受力條件；同時(shí)我們采用了過表達(dá)和干擾目的基因片段的技術(shù)方法,從細(xì)胞力學(xué)角度和分子生物學(xué)角度證明了PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細(xì)胞的成骨分化,并且過表達(dá)PERK可促進(jìn)周期性牽張力介導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞向成骨向分化。這有助于我們更好地理解牙周膜干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制以及進(jìn)一步探索牙齒移動(dòng)過程中牙周組織重塑的機(jī)理,為臨床上實(shí)現(xiàn)牙齒快速移動(dòng)提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5

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本文編號：1242713