研究背景及目的正畸治療過程中,外力通過矯治器作用于牙齒,傳遞至牙周膜,引起牙周組織、牙槽骨的生物力學反應,最終移動牙齒而達到矯正的目的。力學刺激由牙齒傳遞到牙周組織,牙周膜發(fā)揮了重要的橋梁作用。牙周膜是位于牙根和牙槽骨之間的一層質(zhì)地緊密的結(jié)締組織膜,由細胞和基質(zhì)纖維構(gòu)成。作用到牙齒上的力刺激經(jīng)牙周膜進一步傳遞至牙根周圍的牙槽骨。牙周組織改建成功與否關(guān)鍵在于牙周膜干細胞(periodontal ligaments stem cells, PDLSCs),它既是正畸矯治力的直接感應細胞,能將機械應力轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)外的生物化學信號；又是正畸力的效應細胞,在外力作用下可分泌并釋放多種細胞因子及生長因子,還可能同時參與骨吸收和骨形成過程。有研究表明,PDLSCs含有具備分化潛能的成纖維細胞群,正畸機械作用力可誘導PDLSCs向成骨細胞向分化,進一步參與骨形成與骨吸收,這是正畸牙槽骨改建重塑的關(guān)鍵所在。當PDLSCs受到力學刺激后,機械和物理信號轉(zhuǎn)換為細胞內(nèi)生化信號的分子機制是十分復雜的,包括多條信號轉(zhuǎn)導途徑。例如,一氧化氮(NO)、骨形成蛋白2(BMP2)、轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1)、前列腺素12(PGl2)、前列腺素E2 (PGE2)、動力敏感鈣離子通道等。近來也有研究表明細胞核內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的相關(guān)骨形成轉(zhuǎn)錄因子也參與了這一復雜的調(diào)控途徑。我們的前期實驗已經(jīng)證實了轉(zhuǎn)錄激活因子4(Activating transcription factor-4, ATF4)參與了正畸牙齒移動這一過程,在施加正畸力后ATF4的表達上調(diào),過表達ATF4后成骨相關(guān)因子表達量也升高,進一步促進PDLSCs成骨分化。ATF4是cAMP反應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,它能調(diào)節(jié)成骨細胞分化和骨形成,而蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase, PERK)在ATF4的上游發(fā)揮作用。PERK是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白,它的結(jié)構(gòu)包括信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域,其N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),C端位于胞漿側(cè)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞內(nèi)一種很重要的細胞器,是蛋白質(zhì)翻譯合成和儲存鈣離子的場所。當細胞受到缺氧、鈣離子平衡失調(diào)等刺激時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一些未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積,內(nèi)環(huán)境的Ca++濃度改變,進而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡,此時相應的信號通路將激活,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)。 ERS主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種蛋白-PERK, ATF6,肌醇酶1 (inositol requiring enzym E1, Ire1)介導,其中PERK的激活處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的中心地位,作用涉及PERK-eIF2a-ATF4信號通路。在ERS條件下,PERK被激活,導致真核細胞起始因子2a (Eukaryotic initiation factor 2a, eIF2α)磷酸化,進而減弱下游的因子的翻譯表達來抑制蛋白質(zhì)的合成。但與其他因子不同的是,ATF4能夠“躲避”eIF2α磷酸化的作用,在eIF2α磷酸化的情況下能夠上調(diào)ATF4,產(chǎn)生一系列效應。有學者發(fā)現(xiàn)在心血管、腎臟等組織器官內(nèi)以及軟骨細胞增殖分化過程中,力學刺激上調(diào)ATF4表達涉及PERK,也有研究表明PERK-eIF2a-ATF4信號通路介導的ERS參與成骨細胞的成骨向分化；正畸牙移動有賴于力刺激下牙周組織和骨組織的改建,其中成骨細胞在骨形成和破骨細胞附著分化方面有重要作用,受力PDLSCs的PERK、ATF4表達上調(diào),而二者均與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化折疊有關(guān),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的重要信號分子。由此推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路可能參與正畸加力時牙周組織改建過程,并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。但關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在正畸牙齒移動中牙周膜干細胞成骨分化的作用國內(nèi)外均未見報道。本研究通過人牙周膜干細胞的原代培養(yǎng),構(gòu)建牙周膜干細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型,并檢測不同加力時間點后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子和成骨相關(guān)基因的表達的水平變化,并在此基礎(chǔ)上,采用慢病毒質(zhì)粒包裝構(gòu)建過表達、沉默表達PERK的穩(wěn)定細胞系,對正常牙周膜干細胞和病毒轉(zhuǎn)染的牙周膜干細胞實施應力刺激,研究ERS介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞的成骨向分化過程中的作用。本課題試圖闡明力學因素下PERK-eIF2a-ATF4信號通路在調(diào)控人牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用,為臨床矯治提供理論依據(jù),為進一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物學機制提供科學依據(jù),提高矯治效果提供新的思路和方向。研究方法1.人牙周膜干細胞分離培養(yǎng)及鑒定采用傳統(tǒng)的組織塊法分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞,從而獲得原代人牙周膜干細胞。傳代后對細胞進行形態(tài)學觀察,并利用血細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù),繪制生長曲線。通過免疫細胞化學染色和流式細胞術(shù)對培養(yǎng)的人牙周膜干細胞進行鑒定。2.觀察牽張力加載下人牙周膜干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子及成骨相關(guān)因子的表達變化選擇第4-6代生長旺盛,性質(zhì)穩(wěn)定的人牙周膜干細胞進行實驗。將細胞以2.5×105/孔的密度接種于BioFlex彈性膜六孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)24小時后換用含2%胎牛血清的條件培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時后將培養(yǎng)板置于多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)中,對細胞施加振幅10%,頻率0.5HZ的周期性牽張力,加力作用時間為1h,3h,6h,12h,18h,24h。在相應的時間點,提取總RNA和核蛋白,采用熒光定量PCR和Western Blot測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子(Bip, Xbp1, PERK, eIFα, p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因ATF4, OCN, BSP的表達變化。3.分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化中的作用利用上海吉凱公司設(shè)計合成并進行慢病毒包裝獲得過表達PERK基因的慢病毒,干擾PERK基因的慢病毒以及陰性對照的慢病毒。對人牙周膜干細胞進行病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建過表達和沉默PERK的牙周膜干細胞模型,隨后進行靶細胞感染預實驗以及病毒感染復數(shù)(MOI)值得摸索,利用最佳MOI值對靶細胞進行感染,通過熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達和干擾PERK的牙周膜干細胞內(nèi)PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素紅染色來評價基質(zhì)礦化的程度,同時對感染病毒的細胞也進行了牽張力的加載,拉伸強度10%,頻率0.5HZ,加力12h。采用熒光定量PCR和Western Blot檢測p-eIF2α和成骨相關(guān)基因-ATF4, OCN和BSP的表達水平來進一步分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牙周膜干細胞成骨分化中的作用。結(jié)果1.采用組織塊法成功分離培養(yǎng)了原代的人牙周膜干細胞,傳代后牙周膜干細胞生長旺盛,狀態(tài)良好,形態(tài)上具備成纖維細胞的特性,約傳代后2-3天開始指數(shù)增長,8天達到峰值。人牙周膜干細胞通過染色發(fā)現(xiàn)波形絲蛋白陽性,角蛋白染色陰性證明其為來源于間充質(zhì)的細胞群,并通過成骨誘導和成脂誘導表明人牙周膜干細胞具有多向分化能力。2.人牙周膜干細胞在牽張力作用下形態(tài)發(fā)生一些變化,細胞明顯被拉伸,在培養(yǎng)板上逐漸呈方向性生長。細胞加力后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子(Bip,Xbpl,PERK, eIF2α, p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因(ATF4,OCN, BSP)的表達均發(fā)生了一些變化。Bip在加力后6h之內(nèi)變化不明顯,12h-24h后表達量逐漸增加；Xbp1的變化略有一些波動,在加力3h和6h后表達略有下降,但12h后表達又開始上升。PERK表達量在加力后逐漸增加,加力3h和6h時表達達一個峰值,隨后隨時間延長逐漸恢復到一個穩(wěn)定的水平；p-eIF2α的表達在加力早期升高不明顯,隨加力時間增加而表達量升高,6h達峰值,而eIF2α基本沒變化。另一方面,成骨相關(guān)基因-ATF4,骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表達水平基本上隨加力時間延長而升高。ATF4在加力早期1h后就急劇升高并達到峰值,3h和6h時有所下降,后隨加力時間逐漸升高；OCN和BSP變化比較有規(guī)律,隨加力時間延長而表達量逐漸增加。結(jié)果證實了周期性張應力可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子的表達以及牙周膜干細胞相關(guān)成骨基因的表達。3.采用慢病毒對細胞進行轉(zhuǎn)染處理,熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染后72h后病毒轉(zhuǎn)染效率最高。熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞在過表達PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到顯著的提高,而在PERK干擾后PERKR的mRNA和蛋白水平顯著下降,并且單獨轉(zhuǎn)染陰性載體的牙周膜干細胞與正常牙周膜干細胞無明顯差異,慢病毒轉(zhuǎn)染成功。茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)了PERK過表達的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結(jié)節(jié),說明PERK的過表達促進了牙周膜干細胞的成骨分化；而PERK干擾的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后幾乎看不到鈣結(jié)節(jié),說明PERK干擾抑制了牙周膜干細胞的成骨分化。通過熒光定量PCR和Western Blot對牙周膜干細胞內(nèi)相關(guān)成骨基因的水平進行測定,證實了PERK過表達可以有效促進p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達,牽張力刺激增加這一效應,而PERK抑制減少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達,在牽張力刺激下,對p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達有所升高但不如PERK過表達組和PERK過表達同時加力組。結(jié)論1.牽張力刺激促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子(Bip, Xbp1, PERK, p-eIF2a)及成骨相關(guān)基因(ATF4, OCN, BSP)的表達變化,牽張力刺激可以在一定程度上誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生,從而進一步激活PERK-eIF2a-ATF4信號通路。2. PERK過表達可以促進鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度,進而促進牙周膜干細胞成骨分化；而PERK干擾則減少鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度,抑制牙周膜干細胞成骨分化。3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化的過程。PERK過表達可以有效促進p-eIF2P, ATF4, OCN和BSP的表達,牽張力刺激增加這一效應,牽張力刺激和PERK過表達對牙周膜干細胞成骨基因表達有協(xié)同作用；而PERK抑制減少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表達。意義和創(chuàng)新點本課題首次研究了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用,提出了周期性牽張力作為一種應激刺激可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應；并建立了體外加力刺激模型,更好的模擬了體內(nèi)受力環(huán)境和受力條件；同時我們采用了過表達和干擾目的基因片段的技術(shù)方法,從細胞力學角度和分子生物學角度證明了PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細胞的成骨分化,并且過表達PERK可促進周期性牽張力介導的牙周膜干細胞向成骨向分化。這有助于我們更好地理解牙周膜干細胞成骨分化的細胞生物學機制以及進一步探索牙齒移動過程中牙周組織重塑的機理,為臨床上實現(xiàn)牙齒快速移動提供一定的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5

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本文編號：1242713