本文關(guān)鍵詞：小干擾RNA沉默YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：研究背景牙周膜是一個(gè)自我更新的系統(tǒng),牙周組織中存在一種原始的、可產(chǎn)生不同表型的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs),后將其命名為牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs).自2004年被發(fā)現(xiàn)以來,PDLSCs即引起口腔界地極大關(guān)注,它除具有干細(xì)胞基本特性外,還具有形成骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周韌帶樣結(jié)構(gòu)組織的特性,越來越多地研究證實(shí)PDLSCs在維持牙周組織動(dòng)態(tài)平衡和缺損修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,PDLSCs被認(rèn)為是牙周組織工程中最具有潛力的種子細(xì)胞。然而,PDLSCs的組織來源少,體外擴(kuò)增極易老化,并且增殖活性和分化潛能受供體年齡和身體狀況等多種因素的影響,這使PDLSCs的研究應(yīng)用受到極大限制。干細(xì)胞生命活動(dòng)受多種信號(hào)通路的調(diào)控,在不同的時(shí)間空間條件下,干細(xì)胞有絲分裂可能會(huì)走向老化、凋亡、分化等不同的命運(yùn)。Hippo信號(hào)通路是新近發(fā)現(xiàn)的一種與控制器官大小和腫瘤形成有關(guān)的蛋白激酶級聯(lián)通路,YAP (Yes-associated protein)是此通路中一個(gè)重要的信號(hào)蛋白,Hippo上游分子主要通過調(diào)控YAP活性從而介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。YAP在多種組織干細(xì)胞和前體細(xì)胞中均見有高表達(dá),在維持干細(xì)胞特性、促進(jìn)細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明Hippo信號(hào)通路參與小鼠牙齒發(fā)育過程,改變牙源性上皮細(xì)胞YAP的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致牙齒形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)的異常,目前尚未見YAP對PDLSCs作用的相關(guān)報(bào)導(dǎo)與研究。此外,Hippo信號(hào)通路和與形態(tài)發(fā)生相關(guān)的TGF-β、Wnt等信號(hào)通路存在多種交叉會(huì)話,各通路之間信號(hào)傳遞從而組成一種高度復(fù)雜而有序地的信息網(wǎng)絡(luò),從而有序協(xié)調(diào)地調(diào)控細(xì)胞生長。目前關(guān)于PDLSCs的細(xì)胞生物學(xué)特性調(diào)控機(jī)制尚不十分明確。研究目的本實(shí)驗(yàn)擬采用小干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)沉默人牙周膜干細(xì)胞(Human-periodontal ligament stem cells, h-PDLSCs) YAP基因,研究YAP基因沉默對hPDLSCs增殖、凋亡及成骨向分化等生物學(xué)行為的影響。材料和方法1.原代h-PDLSCs的獲取經(jīng)酶解組織塊法分離、有限稀釋克隆法純化、流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞表面標(biāo)記；擴(kuò)大培養(yǎng)。2.設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA序列,非特異性序列一條、人YAP靶向siRNA序列三條,以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為載體將siRNA序列轉(zhuǎn)入h-PDLSCs,分別設(shè)為NC (Negative Control)、siRNA-1、2、3組,僅使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體干預(yù)組設(shè)為空白組。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染后YAP表達(dá)水平。3.分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5天五個(gè)時(shí)間點(diǎn),使用細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測YAP-siRNA對h-PDLSCs增殖活性的影響；于轉(zhuǎn)染后72h使用細(xì)胞周期檢測試劑盒流式檢測分析siRNA干擾后細(xì)胞周期分布,并檢測YAP下游轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖與皮間轉(zhuǎn)化信號(hào)等相關(guān)的靶基因——結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor, CTGF)表達(dá)水平。4.于轉(zhuǎn)染后72h,使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀檢測siRNA干擾后細(xì)胞凋亡率的變化。5.采用RT-PCR技術(shù)檢測YAP-siRNA干擾后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(RUNX2、 OCN、ALP、Collagen Ⅰ)的表達(dá)水平。6.采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,設(shè)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTGF在這一過程中介導(dǎo)重要功能但需進(jìn)一步驗(yàn)證；在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表達(dá)成骨分化標(biāo)志基因Collagen Ⅰ、ALP、OCN,其中OCN表達(dá)上調(diào)五倍,這表明YAP可能與h-PDLSCs成骨方向分化有關(guān)。因此我們認(rèn)為,YAP可能在h-PDLSCs細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用,YAP對h-PDLSCs的作用及作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記：MSCs表面標(biāo)記CD73+、CD44+等(98%-99.4%),造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45-、HLA-DR-等。(0.28±0.012%),本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)獲得細(xì)胞為h-PDLSCs;在1AP-siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí),siRNA-1組、siRNA-2組與空白組和NC組相比,h-PDLSCs的YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P0.01),且蛋白表達(dá)水平在被轉(zhuǎn)染后48、72小時(shí)之間無顯著差異,另外,這表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的siRNA-1、siRNA-2序列可以持續(xù)特異有效地抑制YAP的表達(dá)；CCK-8增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-1、 siRNA-2組細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示siRNA-/1、 siRNA-2組h-PDLSCs細(xì)胞周期也發(fā)生改變——G0/G1及S期細(xì)胞比例增多(P0.01)、G2期細(xì)胞比例明顯減少(P0.05), YAP下游靶基因CTGF蛋白表達(dá)量也降低；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率顯示siRNA-/1、siRNA-2組h-PDLSCs早期及晚期凋亡率均增加；YAP-siRNA轉(zhuǎn)染后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(Collagen Ⅰ、 ALP、OCN)的mRNA表達(dá)水平顯著升高,尤以O(shè)CN最為明顯。結(jié)論siRNA沉默YAP基因后h-PDLSCs增殖活性降低,細(xì)胞周期分布發(fā)生改變一一被阻滯于G0/G1及S期,h-PDLSCs凋亡率明顯增加,由此可見,h-PDLSCs表達(dá)的YAP可促進(jìn)h-PDLSCs增殖并抑制凋亡。此外,細(xì)胞增殖活性的改變可能與細(xì)胞周期被阻滯、細(xì)胞凋亡率增加有關(guān),我們還推測YAP下游靶基因CTGF在這一過程中介導(dǎo)重要功能但需要進(jìn)一步驗(yàn)證：在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表達(dá)成骨分標(biāo)志基因Collagen I、ALP、OCN,其中OCN表達(dá)上調(diào)五倍,這表明YAP可能與h-PDLSCs成骨方向分化有關(guān)。因此我們認(rèn)為,YAP可能在h-PDLSCs細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用,YAP對hPDLSCs的作用及作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.4

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