本文關(guān)鍵詞：周期性張應(yīng)力對(duì)人牙周膜細(xì)胞Periostin與Ⅰ型膠原表達(dá)的影響

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【摘要】：研究背景和目的：口腔正畸過(guò)程中,力學(xué)因素對(duì)牙周組織改建的影響貫穿了治療整個(gè)過(guò)程。人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)是人牙周組織的主要成分,是矯治力的直接效應(yīng)細(xì)胞,不僅合成了人牙周膜細(xì)胞外基質(zhì)中大多數(shù)的各型膠原纖維和蛋白多糖,而且還通過(guò)分泌和合成多種細(xì)胞因子與酶觸發(fā)多條胞外及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),共同參與調(diào)節(jié)牙周組織的代謝和改建。而hPDLCs如何將力學(xué)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生化學(xué)信號(hào),最終引起基因表達(dá)變化,而這一過(guò)程是如何進(jìn)行的,其中涉及哪些信號(hào)通路有哪些相關(guān)基因表達(dá),其確切機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的前沿課題。以往研究表明許多細(xì)胞因子,激素和神經(jīng)肽等物質(zhì)通過(guò)局部或全身途徑影響牙周細(xì)胞來(lái)促進(jìn)正畸牙的牙周組織改建。如何應(yīng)用細(xì)胞因子控制正畸牙移動(dòng),以達(dá)到縮短矯治療程,是當(dāng)前口腔正畸學(xué)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。Periostin(PN)屬成束蛋白(fasciclin)家族成員,分子量為90kD,主要由氨基末端(EMI域)、4個(gè)重復(fù)成束蛋白結(jié)構(gòu)域(fasl域)和羧基末端(C末端)構(gòu)成,在牙周膜和骨膜特異性表達(dá)。PN是一種力學(xué)敏感因子,在機(jī)械應(yīng)激導(dǎo)致的組織修復(fù)和再生,以及維護(hù)牙周組織的完整性、牙齒的發(fā)育以及萌出發(fā)揮著重要的作用。這提示PN可能在人正畸牙周組織改建扮演重要的角色,而目前PN僅僅限于嚙齒動(dòng)物牙齒發(fā)育及萌出方面的體內(nèi)外試驗(yàn)性研究而在正畸領(lǐng)域研究較少,從體外細(xì)胞基因和蛋白水平研究應(yīng)力下人牙周膜細(xì)胞PN的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。因?yàn)镻N與Ⅰ型膠原存在共同的分布區(qū)域,且可直接與Ⅰ型膠原結(jié)合,有研究發(fā)現(xiàn)PN基因剔除的小鼠膠原纖維的直徑減小,膠原交聯(lián)水平降低,這就提示了PN可調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原纖維的合成,成為纖維結(jié)締組織的生物力學(xué)特性的重要介質(zhì)。Ⅰ型膠原作為人正畸牙牙周組織改建的最終產(chǎn)物之一,而PN可調(diào)節(jié)纖維形成和膠原蛋白的交聯(lián),因此,兩者有可能通過(guò)某種信號(hào)通路或多種信號(hào)通路交叉聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)采用Flexcell-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)的hPDLCs加載機(jī)械力,構(gòu)建細(xì)胞力學(xué)刺激模型,模擬正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中的施力方式,從細(xì)胞基因水平和蛋白水平研究PN與Ⅰ型膠原在hPDLCs中的表達(dá)的情況,初步探討PN與Ⅰ型膠原在周期性張應(yīng)力引起的hPDLCs細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用,有助于了解PN與Ⅰ型膠原之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路,為進(jìn)一步闡明牙周組織在正畸矯治力作用下的適應(yīng)性改建機(jī)理及機(jī)械力信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。本論文主要包括以下兩部分內(nèi)容：第一部分hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型的構(gòu)建目的：體外分離培養(yǎng)hPDLCs,通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)特征,檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線,礦化能力并進(jìn)行免疫組化鑒定。細(xì)胞加力后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、排列及增殖情況,確定是否成功構(gòu)建力學(xué)刺激模型。方法：1.分離培養(yǎng)hPDLCs收集臨床新鮮拔除的牙周健康、無(wú)齲的智齒或正畸拔除牙,刮下根中1/3牙周膜組織,采用改良型組織化酶消化法培養(yǎng)。2. 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征：利用MTT法檢測(cè)hPDLCs的生長(zhǎng)增殖情況,繪制生長(zhǎng)曲線；對(duì)細(xì)胞礦化誘導(dǎo)21d后,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá),對(duì)hPDLCs來(lái)源進(jìn)行初步鑒定。3.將第4-6代hPDLCs隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分為施加周期性張應(yīng)力6h、12h、24h、48h,以加力0h為對(duì)照組。4.周期性張應(yīng)力加載采用Flexcell FX-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng),具體設(shè)置為：正弦波,形變10%,頻率0.5 Hz。加力后利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、排列的情況。5.四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)：在細(xì)胞加力6h、12h、24h、48h后,每孔加入5g/L的MTT 200ml,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄上清液,當(dāng)各組反應(yīng)完成后,每孔加入3m1二甲基亞砜(DMSO),充分振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔細(xì)胞490nm波長(zhǎng)的光吸收值(OD值)。結(jié)果：1. 改良型組織塊酶消化法分離培養(yǎng)hPDLCs,游出率和成活率較高。形態(tài)學(xué)觀察顯示：游出細(xì)胞多為梭形或星形。傳代細(xì)胞在24h后貼壁,貼壁后hPDLCs逐漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形,呈放射狀或漩渦狀生長(zhǎng)。2.細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì),曲線成倒S型,符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律；礦化誘導(dǎo)染色,鏡下可見(jiàn)散在紅色礦化結(jié)節(jié),具成骨能力；免疫細(xì)胞染色顯示波形絲蛋白染色細(xì)胞胞漿可見(jiàn)黃色顆粒,角蛋白染色細(xì)胞胞漿未見(jiàn)黃色顆粒；以上表明細(xì)胞取材于牙周膜組織,屬于中胚層來(lái)源細(xì)胞,且無(wú)上皮細(xì)胞的污染,證實(shí)是hPDLCs,可用于進(jìn)一步的研究。3.加力后細(xì)胞形態(tài)排列的情況：細(xì)胞基本無(wú)脫落,生長(zhǎng)狀態(tài)良好；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；細(xì)胞排列更加有序,由漩渦狀排列逐漸向柵欄狀平行生長(zhǎng),與加載牽張力的方向相一致。4.檢測(cè)加力后細(xì)胞增殖活性的MTT結(jié)果表明：與對(duì)照組比較,加力6h時(shí)細(xì)胞增殖活性降低,加力12h開(kāi)始增強(qiáng),加力24h增殖活性繼續(xù)增強(qiáng)達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)的峰值,而加力48h細(xì)胞增殖活明顯降低。5. hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型成功構(gòu)建。第二部分 周期性張應(yīng)力對(duì)人牙周膜細(xì)胞Periostin與Ⅰ型膠原表達(dá)的影響目的：旨在了解體外培養(yǎng)的hPDLCs加載周期性張應(yīng)力后hPDLCs Periostin與Ⅰ型膠原表達(dá)的影響,初步探討PN與Ⅰ型膠原在應(yīng)力下hPDLCs細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用。方法：1.本實(shí)驗(yàn)將第4-6代hPDLCs隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分為施加周期性張應(yīng)力6h、12h、24h、48h,以加力0h即不加力為對(duì)照組。對(duì)實(shí)驗(yàn)組加載形變10%,頻率0.5 Hz的周期性張應(yīng)力。2. qRT-PCR:使用Trizol提取牙周膜細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用SYBR green法進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量法計(jì)算2-△△Ct值,檢測(cè)PN與Ⅰ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)情況。3. Western blot:蛋白裂解液獲取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度, SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯影及定影,檢測(cè)人牙周膜細(xì)胞PN蛋白的表達(dá)。用Quanlity one圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行灰度值分析。4. 重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)所測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊,組間比較則用LSD檢驗(yàn),方差不齊選用Dunnett's T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05,P0.05認(rèn)為有顯著差異。結(jié)果：1. qRT-PCR結(jié)果顯示：PN mRNA的表達(dá)：在正常hPDLCs內(nèi)表達(dá)PN mRNA,加載張應(yīng)力6h后,PN mRNA表達(dá)降低(P0.05),而在加力12h后,表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),此后持續(xù)增強(qiáng)至加力24h達(dá)最高峰(P0.05),48h后開(kāi)始下降恢復(fù)至不加力時(shí)的表達(dá)水平(P0.05)；Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組相比,加載張應(yīng)力6h,12h后,Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變,加力24h,表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),此后持續(xù)增強(qiáng)至加力48h達(dá)最高峰(P0.05)。2.經(jīng)Westernblot檢測(cè)：細(xì)胞加載張應(yīng)力6h時(shí),PN蛋白表達(dá)明顯降低(P0.01),加力12h后PN蛋白表達(dá)開(kāi)始逐漸升高,并持續(xù)到加力24h時(shí),PN蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),達(dá)到最高水平(P0.01)；而在加力48h時(shí),PN蛋白表達(dá)開(kāi)始下降,恢復(fù)至不加力時(shí)的表達(dá)水平(P0.05)。全文結(jié)論：1.改良型組織塊酶消化法能成功培養(yǎng)出hPDLCs,并成功構(gòu)建hPDLCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型。2.在一定時(shí)間內(nèi)的周期性張應(yīng)力(形變率為10%,頻率為0.5Hz,波形為正弦波)加載可促進(jìn)hPDLCs PN與Ⅰ型膠原表達(dá),Ⅰ型膠原表達(dá)增強(qiáng)明顯晚于PN表達(dá)基因,兩者表達(dá)具有時(shí)序性,推測(cè)Ⅰ型膠原位于PN的下游發(fā)揮作用。3.周期性張應(yīng)力作用下,PN與Ⅰ型膠原參與了細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。4.PN與Ⅰ型膠原可能作為主要的調(diào)控因子參與正畸牙周組織的改建。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Sputum interleukin-17 is increased and associated with airway neutrophilia in patients with severe asthma[J];Chinese Medical Journal;2005年11期

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本文編號(hào)：1206349