本文關(guān)鍵詞：PEN載體傳遞ODN對人成骨樣細(xì)胞細(xì)胞周期與成骨分化的影響

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【摘要】：寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)是一種單鏈寡核苷酸,易于與它們的互補鏈相對接,在數(shù)量上通常含有50個以下的堿基,在自然界中常存在于DNA或RNA的降解產(chǎn)物中。MT01包含有27個堿基,是依據(jù)人線粒體DNA設(shè)計的特定序列的ODN,目前已被證實,MT01可以通過Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)和Toll樣受體7(Toll like receptor 7,TLR7)促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化,抑制破骨細(xì)胞的成熟,阻止大鼠牙周炎模型中牙槽骨的破壞性吸收,對牙槽骨骨重塑具有影響作用。MT01被細(xì)胞攝取的主要方式為胞吞作用,然而由于MT01表面帶有負(fù)電荷,易與細(xì)胞表面的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電排斥反應(yīng),不易被細(xì)胞攝取。同時,MT01在體內(nèi)并不穩(wěn)定,易被核酸酶降解,因而其細(xì)胞的攝取效率較低。目的:為提高M(jìn)T01的攝取效率,本實驗擬采用新型載體N-異丙基丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺(N-Isopropylacrylamide-Modified Polyethylenimines,PEN)對MT01進(jìn)行傳遞。通過檢測人成骨樣細(xì)胞(MG63)的細(xì)胞周期及成骨相關(guān)因子的表達(dá),探討PEN是否能成為MT01的高效載體對MG63的成骨分化產(chǎn)生影響。方法:本實驗將對MT01和PEN分別以1:2、1:4、1:6三種不同的裝載比例進(jìn)行靜電裝載,形成MT01/PEN復(fù)合物后對MG63細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別設(shè)置PEN、MT01及S-MT01三組作為對照組,三種比例的MT01/PEN復(fù)合物作為實驗組。選取四種指標(biāo)進(jìn)行測定,評估MT01/PEN復(fù)合物對MG63增殖分化的影響。實驗一對轉(zhuǎn)染后的MG63進(jìn)行染色,選用流式細(xì)胞儀檢測MG63細(xì)胞周期的變化,實驗二檢測成骨分化相關(guān)蛋白ALP的活性,實驗三使用ELISA法檢測BMP2蛋白表達(dá)情況,實驗四使用ELISA法檢測OCN蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:MG63細(xì)胞周期檢測結(jié)果:與陰性對照組及MT01組相比,MT01/PEN復(fù)合物組MG63處于Gl、G2期細(xì)胞比例減少,處于S期細(xì)胞比例增加(P0.01)。與S-MT01組相比,MT01/PEN復(fù)合物組MG63處于G2期細(xì)胞比例均減少,處于S期細(xì)胞比例增加(P0.01),G1期細(xì)胞比例增加(P0.01)。ALP活性檢測結(jié)果:與陰性對照組及MT01組相比ALP活性明顯增高(p0.01),同S-MT01組相比,1:4及1:6比例的MT01/PEN復(fù)合物在24h、72h時導(dǎo)致MG63中ALP活性升高(p0.01),而在48h時,三種比例MT01/PEN復(fù)合物均可引發(fā)MG63內(nèi)ALP活性升高(p0.01)。BMP2檢測結(jié)果:與陰性組相比,其余各組BMP2表達(dá)均有增加;與MT01、S-MT01組相比,PEN/MT01復(fù)合物在24h BMP2表達(dá)上升;在72h,與MT01組及S-MT01組比較,比例為1:2與1:6的PEN/MT01復(fù)合物BMP2表達(dá)升高。OCN檢測結(jié)果:除72h MT01組,余各組與同時間點陰性組相比,OCN表達(dá)增加;24h和48h,1:6比例MT01/PEN組OCN表達(dá)高于MT01組(p0.05);不同比例MT01/PEN組復(fù)合物與S-MT01組相比,OCN表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異與MT01組以及S-MT01組相比。結(jié)論:PEN可以做為一種高效載體,提高M(jìn)T01的轉(zhuǎn)染效率。不同裝配比例的MT01/PEN復(fù)合物均可對成骨樣細(xì)胞的增殖分化有影響,其中裝配比例在1:6時其影響最為明顯。MT01/PEN復(fù)合物可以通過影響MG63的細(xì)胞周期,縮短細(xì)胞進(jìn)入S期的時間促進(jìn)其增殖,且其促進(jìn)效果明顯優(yōu)于MT01、S-MT01。MT01/PEN復(fù)合物可以增加成骨相關(guān)因子如ALP、OCN、BMP2的表達(dá)。且其促進(jìn)效果明顯優(yōu)于MT01、S-MT01。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R783.5

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本文編號：1188354