本文關(guān)鍵詞：纖維連接蛋白修飾的種植體3D微溝槽形貌頸圈對人牙齦成纖維細(xì)胞生物活性影響的研究

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【摘要】：目前在頜骨中植入鈦種植體已成為修復(fù)牙缺失及骨折的常規(guī)方法。種植體作為牙列缺失后天然牙的替代物,其植入后與頜骨形成種植體-骨界面,與牙周組織種植體-軟組織界面。人的口腔環(huán)境復(fù)雜,種植體若要長期存在并具有功能,首先要有堅固的骨性結(jié)合存在于種植體與牙槽骨之間,再者需要良好的軟組織封閉位于種植體頸部起到屏障作用,兩者同等重要。種植體表面黏附了牙齦結(jié)合上皮及牙齦纖維后組成這層屏障。由牙齦成纖維細(xì)胞及其分泌合成的膠原纖維構(gòu)成的種植體周圍結(jié)締組織附著于種植體表面,是種植體穿齦部分軟組織愈合的重要組成部分,這部分結(jié)構(gòu)如果愈合良好,能為表層上皮提供堅實的基底組織,防止上皮根方遷移,加強(qiáng)邊緣封閉,減少細(xì)菌入侵,減少了因種植體周圍軟組織炎癥引起的牙齦退縮而導(dǎo)致前牙美觀問題,同時也保護(hù)了深層骨組織愈合。研究表明種植體頸部表面的化學(xué)成分以及性質(zhì),種植體材料的生物相容性及形狀結(jié)構(gòu)均可對細(xì)胞附著產(chǎn)生影響,其中種植體頸部表面的幾何結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)變成目前的熱點。種植體頸圈的微米級溝槽形貌設(shè)計,該結(jié)構(gòu)設(shè)計使種植體穿齦部分具有良好的親水性和生物相容性,增加了種植體穿齦部分的表面積,提供更多黏附蛋白如纖維連接蛋白(FN)的黏附位點,有利于促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞分泌更多的內(nèi)源性FN,也可吸附和激活更多血小板,共同促進(jìn)后續(xù)更多牙齦成纖維細(xì)胞黏附聚集。經(jīng)研究證實,在眾多溝槽尺寸中親水性及生物相容性最佳的溝槽尺寸為T60/10(60微米寬10微米深)溝槽形貌。但T60/10仍有不足,其對血漿纖維連接蛋白(FN)的黏附能力有限,而FN作為一種細(xì)胞外基質(zhì)大分子量的蛋白,具有多種功能,其可以增加成纖維細(xì)胞附著數(shù)量,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。由于T60/10對促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞早期的黏附并未達(dá)到最佳,而種植體植入早期是種植體頸部如未及時地形成良好的軟組織封閉,易導(dǎo)致感染的發(fā)生,因此改進(jìn)T60/10的不足,在植入早期促進(jìn)其在種植體頸部形成良好的軟組織封閉至關(guān)重要。目的:本課題以進(jìn)一步提高T60/10溝槽頸圈早期軟組織愈合為出發(fā)點,對微米級的溝槽鈦表面進(jìn)行血漿纖維連結(jié)蛋白(FN)的修飾,彌補(bǔ)T60/10溝槽對血漿FN吸附能力較弱的不足,明顯提高材料表面對血漿FN的吸附率。通過體外實驗評價修飾FN后的T60/10溝槽對牙齦成纖維細(xì)胞在增殖、黏附及分泌合成功能等生物學(xué)行為的影響,為進(jìn)一步研究改良后的材料與軟組織早期附著的關(guān)系提供基礎(chǔ),同時為今后新材料的開發(fā)提供實驗依據(jù)。方法:采用硅烷化的方法對微米級的溝槽鈦表面進(jìn)行血漿FN的修飾。通過X線衍射能譜分析、FN蛋白免疫熒光技術(shù)、ELISA檢測修飾于材料表面的FN蛋白含量及分布。同期通過場發(fā)射掃描電鏡、原子力顯微鏡及接觸角檢測儀對修飾FN的材料進(jìn)行表面形貌、粗糙度及表面親水性的檢測。分別在修飾FN的T60/10溝槽鈦表面及光滑鈦表面接種人牙齦成纖維細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng),通過CCK8檢測細(xì)胞的增殖情況;場發(fā)射掃描電鏡、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞的附著情況;考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)、I型膠原纖維ELISA實驗及Real-time PCR技術(shù)檢測修飾了FN后的材料表面對HGF分泌功能的影響。結(jié)果:(1)采用硅烷化的方法對微米級的溝槽鈦表面進(jìn)行血漿FN的修飾后,XPS測得的材料表面元素組成表及ELISA檢測的OD值均表明FN含量明顯多于直接浸泡組,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。通過熒光顯微鏡觀察熒光染色的FN蛋白,發(fā)現(xiàn)其在材料分布均勻,熒光像素明顯高于對照組,同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)場發(fā)射掃描電鏡觀測結(jié)果顯示硅烷化后T60/10的表面并未被硅烷化反應(yīng)過程中的化學(xué)試劑腐蝕,溝槽尺寸不變。原子力顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)修飾FN后的材料粗糙度增加,相對于空白組有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。接觸角檢測儀修飾FN的材料表面潤濕角小于未修飾材料,同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)細(xì)胞的增殖及黏附情況:DAPI染色檢測HGF接種在硅烷化修飾FN的溝槽組和光滑組、空白溝槽組和光滑組鈦金屬表面2h、4h、6h后早期附著的細(xì)胞數(shù)。HGF接種2h時,四組材料表面所觀察到的藍(lán)色熒光亮點數(shù)量較少,數(shù)量基本相同。從4h開始四組材料上黏附的細(xì)胞明顯增多,且硅烷化的兩組材料上黏附的細(xì)胞數(shù)均大于空白組,其中硅烷化溝槽組的細(xì)胞數(shù)最多,硅烷化光滑組的細(xì)胞數(shù)大于空白光滑組,而硅烷化光滑組與空白溝槽組細(xì)胞數(shù)相當(dāng),空白溝槽組表面細(xì)胞數(shù)多于空白光滑組。6h時,四組材料上的細(xì)胞數(shù)增加更加明顯,硅烷化溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)增加最為明顯,細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他三組材料。硅烷化的光滑組也較多于空白溝槽組,上述三個時間段的DAPI染色實驗說明通過硅烷化修飾了FN的材料能有效促進(jìn)HGF對其表面的早期附著。CCK8法檢測HGF接種在硅烷化溝槽組和光滑組、空白溝槽組和光滑組鈦金屬表面6h、12h、1d、3d、5d、7d后細(xì)胞增殖數(shù)量,發(fā)現(xiàn)4組材料上的細(xì)胞數(shù)量隨時間延長而增加,其中在6個時間段,硅烷化溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)量均大于其他三組材料,且都有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);硅烷化光滑組表面的細(xì)胞數(shù)量除了1d大于空白溝槽組外(P0.05)其他時間段均低于未修飾溝槽組(P0.05),而空白光滑組表面的細(xì)胞數(shù)在每個時間段均少于其他三組(P0.05)。熒光顯微鏡觀察HGF在4組不同材料上1d、3d、5d的數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化,細(xì)胞數(shù)量方面觀察結(jié)果與CCK8的結(jié)果基本一致。硅烷化溝槽組與空白溝槽組一樣,細(xì)胞沿著溝槽呈長條形,排列規(guī)則。硅烷化的光滑組與空白光滑組一樣,細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞呈多邊形。硅烷化的兩組材料細(xì)胞伸展范圍較大,細(xì)胞偽足較長。(4)通過1、3、5d考馬斯亮藍(lán)染色及5d的I型膠原纖維ELISA實驗發(fā)現(xiàn),硅烷化的兩組材料上的細(xì)胞外的總蛋白含量及細(xì)胞外I性膠原纖維的數(shù)量均高于空白組材料。經(jīng)過Real-time PCR分析,硅烷化的兩組材料上的HGF的I型膠原纖維m RNA表達(dá)水平較空白組高,以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:采用硅烷化的方法將血漿纖維連接蛋白(FN)修飾在T60/10表面不僅不會改變其表面原有的溝槽形態(tài),還可以增加材料的親水性,彌補(bǔ)其對血漿纖維連結(jié)蛋白吸附能力較弱的不足,修飾FN的材料表面相對空白組均有較好的生物相容性,能有效促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖、黏附。同時修飾FN的材料表面合成蛋白質(zhì)及I型膠原纖維的數(shù)量較空白組多,在硅烷化材料上的HGF其I型纖維m RNA表達(dá)水平較空白組高,由于HGF與其分泌的I型膠原纖維是種植體頸部“頸圈”的重要組成部分,所以修飾FN的材料將在種植體頸部軟組織愈合,預(yù)防感染方面有積極的作用。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.6

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1185201