本文關(guān)鍵詞：唑來膦酸對頜骨影響的基因差異分析

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【摘要】：目的:近年來,越來越多的關(guān)于雙膦酸鹽類藥物引起頜骨壞死的患者被報道,人們開始意識到雙膦酸鹽性頜骨壞死是長期應用雙膦酸鹽類藥物的副反應之一。臨床上發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生與外傷、感染關(guān)系密切,但雙磷酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生機制目前尚不明確。唑來膦酸是雙膦酸鹽類藥物中目前應用最廣泛的,也是抑制骨吸收作用最強的。本實驗采用基因芯片技術(shù),檢測SD大鼠應用唑來膦酸后頜骨組織基因譜的變化,通過基因譜差異分析,探討唑來膦酸對頜骨的作用機制,為臨床預防和治療雙膦酸鹽性頜骨壞死提供實驗數(shù)據(jù)和理論指導。方法:選擇健康3月齡的雌性SD大鼠24只,體重220±20g,自由攝食水,適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組,每組8只。A組(單純應用唑來膦酸組);唑來膦酸經(jīng)腹腔注射,濃度0.1mg/ml,劑量0.2mg/kg,每兩天一次,持續(xù)8周;生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃,每日一次,持續(xù)8周。B組(唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組):唑來膦酸經(jīng)腹腔注射,濃度0.1mg/ml,劑量0.2mg/kg,每兩天一次,持續(xù)8周;將濃度0.84%鈣爾奇(碳酸鈣+維生素D)混懸液按照每100g體重按0.5mL灌胃,每日一次,持續(xù)8周。C組(對照組):按照SD大鼠體重2ml/kg腹腔注射無菌生理鹽水,每兩天一次,持續(xù)8周;生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃,每日一次,持續(xù)8周。8周后,三組動物均停藥,每組8只大鼠再隨機分為拔牙組(2只)和非拔牙組(6只),拔牙組:在10%水合氯醛全麻下拔除SD大鼠左側(cè)下頜第一臼齒,而后繼續(xù)飼養(yǎng)4周處死取下頜骨。非拔牙組:在喂藥開始后的第8周、10周、12周時分別將每組SD大鼠隨機處死2只,取大鼠下頜骨。所有動物均存活到實驗結(jié)束時,在處死前均無異常表現(xiàn)及不良反應。所有的標本立即投入液氮中冷凍,然后將標本放入零下80℃冰箱保存?zhèn)溆�。使用TRIZOL法提取頜骨的總RNA,測定RNA的純度及完整性。應用Affymetrix全基因組表達譜芯片檢測所有標本的基因水平并掃描分析。采用Transcriptome Analysis Console v3.0分析軟件對掃描結(jié)果進行分析,篩選差異基因。結(jié)果:1頜骨總rna純度及完整性的鑒定分光光度法測定結(jié)果:所有標本提取的總rna的od260/od280比值均位于1.9~2.1之間,純度合格。凝膠電泳完整性鑒定結(jié)果:所有標本提取的總rna經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后均可見三個條帶出現(xiàn),且第一條帶(28s)亮度約是第二條(18s)亮度的兩倍,最下面一條(5s)最淡,說明提取的rna完整性良好。2基因芯片檢測分析結(jié)果2.1單純應用唑來膦酸組與對照組比較用藥后8周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)1799個基因表達發(fā)生變化,其中698個基因表達上調(diào),1101個基因表達下調(diào);用藥后10周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)361個基因表達發(fā)生變化,其中158個基因表達上調(diào),203個基因表達下調(diào);用藥后12周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)208個基因表達發(fā)生變化,其中97個基因表達上調(diào),111個基因表達下調(diào);用藥后12周拔牙組,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)180個基因表達發(fā)生變化,其中98個基因表達上調(diào),82個基因表達下調(diào)。2.2唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組與對照組比較用藥后8周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)1287個基因表達發(fā)生變化,其中580個基因表達上調(diào),707個基因表達下調(diào);用藥后10周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)310個基因表達發(fā)生變化,其中193個基因表達上調(diào),117個基因表達下調(diào);用藥后12周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)635個基因表達發(fā)生變化,其中273個基因表達上調(diào),362個基因表達下調(diào);用藥后12周拔牙組,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)320個基因表達發(fā)生變化,其中161個基因表達上調(diào),159個基因表達下調(diào)。2.3單純應用唑來膦酸組與唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組比較用藥后8周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)677個基因表達發(fā)生變化,其中264個基因表達上調(diào),413個基因表達下調(diào);用藥后10周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)303個基因表達發(fā)生變化,其中131個基因表達上調(diào),172個基因表達下調(diào);用藥后12周,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)453個基因表達發(fā)生變化。其中250個基因表達上調(diào),203個基因表達下調(diào);用藥后12周拔牙組,篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)189個基因表達發(fā)生變化,其中115個基因表達上調(diào),74個基因表達下調(diào)。2.4與骨代謝相關(guān)的差異基因分析結(jié)果單純應用唑來膦酸組和對照組比較,用藥后8、10、12周均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶9(Mmp9)、趨化因子9(Ccl9)及原癌基因(c-fos)高表達;唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組與對照組比較,用藥后8、10、12周均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶9(Mmp9)、趨化因子9(Ccl9)及原癌基因(c-fos)及濾泡樣樹突細胞分泌蛋白(FDC-SP)高表達;單純應用唑來膦酸組及唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組內(nèi)拔牙組均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶(Mmp9)表達上調(diào)且上調(diào)倍數(shù)明顯增高;唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組內(nèi)拔牙組發(fā)現(xiàn)濾泡樣樹突細胞分泌蛋白(FDC-SP)表達上調(diào)。對這些基因進行pathway分析,金屬基質(zhì)蛋白酶9(Mmp9)、趨化因子9(Ccl9)及原癌基因(c-fos)是骨代謝關(guān)系密切的MAPK信號通路及RANK/RANKL信號通路上的重要調(diào)節(jié)基因。濾泡樣樹突細胞分泌蛋白(FDC-SP)主要參與牙周的防御反應。結(jié)論:1 SD大鼠全身應用唑來膦酸后頜骨的基因譜發(fā)生改變,一部分基因表達上調(diào),一部分基因表達下調(diào)。其中金屬基質(zhì)蛋白酶9(Mmp9)、趨化因子9(Ccl9)、原癌基因(c-fos)及濾泡樣樹突細胞分泌蛋白(FDC-SP)明顯上調(diào)。2金屬基質(zhì)蛋白酶9(Mmp9)、趨化因子9(Ccl9)、原癌基因(c-fos)可能通過MAPK信號通路及RANK/RANKL信號通路來影響頜骨的骨代謝。3鈣劑、維生素D與唑來膦酸的同時應用與單純應用唑來膦酸對頜骨的影響是有差異的。鈣劑、維生素D與唑來膦酸的同時可能通過上調(diào)與牙周防御相關(guān)的濾泡樣樹突細胞分泌蛋白(FDC-SP)預防雙磷酸鹽性骨壞死的發(fā)生。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R782

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本文編號：1177043