本文關(guān)鍵詞：載辛伐他汀MPEG-PLA納米粒的體內(nèi)成骨效應(yīng)及特性

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【摘要】：研究背景口腔種植經(jīng)常面臨的一個(gè)的挑戰(zhàn)是患者牙槽嵴嚴(yán)重的吸收,吸收往往導(dǎo)致牙槽嵴高度和寬度降低而致種植困難。近年來(lái),大量技術(shù)和骨替代材料如上頜竇提升術(shù)、引導(dǎo)骨再生術(shù)、骨劈開術(shù)、自體骨移植、骨生長(zhǎng)因子材料、骨髓干細(xì)胞材料、高分子生物材料等用來(lái)解決這一問(wèn)題。然而,即便應(yīng)用技術(shù)和這些材料仍存在不足,如需要復(fù)雜的外科手術(shù),需要第二個(gè)手術(shù)部位,成本昂貴,不能啟動(dòng)內(nèi)源性生物因子,成骨作用效能不明顯,引起局部炎癥等。任何的骨損傷都可以通過(guò)釋放和局部產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子和某些信號(hào)分子激活局部骨再生,骨愈合過(guò)程中涉及多種細(xì)胞成分,包括成骨細(xì)胞、干細(xì)胞和生長(zhǎng)因子,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和骨形成蛋白-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2),為了提高骨再生,許多研究組織試圖將生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)及不同藥物加入骨替代用品,一個(gè)理想的骨移植替代物應(yīng)該具有骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)、生物相容性、生物可吸收性,且方便、廉價(jià)、易于使用,生物學(xué)安全。運(yùn)用非蛋白小分子刺激骨內(nèi)源性信號(hào)分子以促進(jìn)骨缺損愈合,小分子藥物已作為間接的促進(jìn)成骨的替代路線,成為近期的研究熱點(diǎn)。辛伐他汀(Simvastatin, SV)是一種臨床上常用的降低血清膽固醇含量的小分子藥物,文獻(xiàn)報(bào)道其能提高骨形成蛋白-2的表達(dá)并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到骨缺損部位、通過(guò)促進(jìn)血管生成、增強(qiáng)新生骨組織中成骨因子的表達(dá)和抑制破骨細(xì)胞活性從而提高成骨作用。然而,SV是一種非活性的脂溶性藥物,具有不易被機(jī)體吸收、血漿半衰期短、口服給藥后攝入率低等缺點(diǎn),因此,尋找合適的藥物載體以增加SV水溶性進(jìn)而促進(jìn)SV的成骨作用成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前,納米化制備技術(shù)逐步正成為解決一些藥物制劑難題的重要手段。納米藥物即利用納米化制備技術(shù)將藥物直接納米化或應(yīng)用納米載藥系統(tǒng),使藥物粒子的粒徑控制在1000 nm以內(nèi),從而改變藥物在制劑中的存在狀態(tài)和性能。單甲氧基聚乙二醇(PEG)-聚乳酸(PLA)嵌段共聚物(MPEG-PLA),是一種高度生物相容的藥物傳遞系統(tǒng),并具有良好的生物降解性,載藥效率高、穩(wěn)定性高、多種表面功能化、可以維持藥物濃度在目標(biāo)位點(diǎn),延長(zhǎng)其藥理活性；可通過(guò)腎臟排出體外等諸多優(yōu)點(diǎn)因而倍受關(guān)注。MPEG-PLA為納米級(jí)核殼型的球形結(jié)構(gòu),具有獨(dú)特的核心-殼結(jié)構(gòu),“內(nèi)核”由疏水部分組成,“外殼”由親水部分組成。這種結(jié)構(gòu)使其具有增強(qiáng)穿透與潴留效應(yīng)的被動(dòng)靶向的功能,能夠在目標(biāo)部位如腫瘤組織及炎癥組織停留較長(zhǎng)的時(shí)間。聚合物納米顆粒主要作為癌癥治療和其他領(lǐng)域的一種先進(jìn)的藥物輸送系統(tǒng)。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于MPEG-PLA納米粒載SV修復(fù)顱骨缺損的研究甚少,關(guān)于載SV MPEG-PLA納米粒復(fù)合無(wú)機(jī)牛骨骨粉的研究尚無(wú)報(bào)道,載SV MPEG-PLA納米粒是否能在臨床上廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)仍需深入研究。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展,我們提出：采用MPEG-PLA聚合物納米粒作為SV的藥物載體,有可能將疏水的SV改變?yōu)橛H水使之具備緩釋特性,從而增加SV的局部濃聚效應(yīng),并由于納米粒本身的理化性能有可能增加SV的促成骨效應(yīng),該科學(xué)假說(shuō)擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以印證。目的1.制備具備納米特性的藥物SV載體,研究其理化特性；2.研究證實(shí)載SV的MPEG-PLA納米粒具備緩釋特性；3.通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),證實(shí)載SV的MPEG-PLA納米粒優(yōu)于單純SV的局部成骨效應(yīng)；4.研究SMP是否通過(guò)促進(jìn)骨形成蛋白2(BMP-2)的表達(dá),以增強(qiáng)局部成骨效應(yīng)。方法1.用改良自乳化溶劑擴(kuò)散法(SESD)法制備空白MPEG-PLA納米粒和辛伐他汀加載MPEG-PLA納米粒(SMP)。用激光粒度儀檢測(cè)SMP的粒徑大小及分布、分散性指數(shù)(P1)和Zeta電位；在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察SMP的形態(tài)；用紫外分光光度法檢測(cè)SMP的包封率(EE)和載藥量(DL)；采用和差示掃描量熱法(DSC)及傅立葉紅外光譜法(FT-IR)檢測(cè)SMP中SV和聚合物材料的物理化學(xué)狀態(tài)；觀察SMP、SV及其分別與BioOss(?)復(fù)合的支架材料的體外釋藥。2.載辛伐他汀PEG-PLA納米粒修復(fù)兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)選取16只6月齡大,體重3-3.5kg的新西蘭健康雄性白兔,隨機(jī)編號(hào)為1～16號(hào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按植入材料分為4組即SMP組、SV組、BS組和BC組,SMP組為5mg SMP(含0.5mgSV)和5 mg BioOss(?)骨粉混合而成的復(fù)合材料,SV組為0.5mg SV和5mg BioOss(?)骨粉混合而成的復(fù)合材料,BS組為5 mgBioOss(?)骨粉和BC組不進(jìn)行材料干預(yù)的空白對(duì)照組。每只白兔沿顱骨的頂骨及額骨正中線兩側(cè)用直徑8 mm高速環(huán)形取骨鉆小心截取骨板,一邊各兩個(gè),缺損間隔不小于2毫米,深約1 mm,保留硬腦膜完整,制作4個(gè)顱骨全層缺損的標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型。4個(gè)骨缺損模型隨機(jī)分別植入上述3種材料,剩下一個(gè)骨缺損模型作空白對(duì)照組BC組。粘骨膜瓣復(fù)位,絲線間斷縫合。觀察術(shù)后白兔的生活狀態(tài)。(2)所有動(dòng)物術(shù)后4周處死,對(duì)骨替代材料及相鄰骨組織進(jìn)行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察和組織形態(tài)學(xué)測(cè)量分析。取出標(biāo)本基于大體形態(tài)學(xué)、影像學(xué)研究新骨愈合的特征；制作硬組織切片,采用熒光標(biāo)記法通過(guò)熒光顯微鏡觀察新骨生成情況以及骨替代材料降解情況；利用常規(guī)病理學(xué)研究脫鈣切片,進(jìn)行HE染色、Masson染色和BMP-2細(xì)胞因子免疫組化染色,通過(guò)HE染色法檢測(cè)骨缺損修復(fù)中骨細(xì)胞、骨小梁、血管和骨基質(zhì)的生成情況,利用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6,IPP)測(cè)量新生骨面積百分比,每組樣本量均為16個(gè)；用馬松三色(Masson)染色法檢測(cè)骨缺損修復(fù)中骨膠原基質(zhì)的分泌情況；利用BMP-2免疫組織化學(xué)染色法觀察成骨細(xì)胞特異性因子BMP-2和成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記物的表達(dá),用圖像分析軟件軟件分析缺損區(qū)域圖像BMP-2相對(duì)表達(dá)量,每組樣本量均為16個(gè)。3.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)脫鈣切片HE染色的新生骨面積百分比、BMP-2免疫組化染色的BMP-2相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示,首先對(duì)組織形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn),若滿足正態(tài)分布和方差齊,采用單因素方差分析(one way ANOVA test),則組間進(jìn)一步行兩兩比較(Bonferroni檢驗(yàn)方法)；假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。當(dāng)P0.05時(shí),差異被認(rèn)為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.載SV的MPEG-PLA聚合物納米粒的特點(diǎn)制備的SMP粒徑值平均為41.3±1.6 nm,PDI為0.162±0.08,zeta納米顆粒的電位是-8.01 mV。TEM觀察顯示：SMP外形呈球形、形態(tài)規(guī)整、表面光滑、分散均勻、沒(méi)有粘附和聚集現(xiàn)象；載藥量為(7.23±1.05)%,包封率為(39.12士1.65)%。用DSC和FT-IR分析可見,大多數(shù)SV被包裹在合成的SMP里,僅少量藥物吸附在納米粒的表面。由SMP和SV體外釋放曲線可見,SMP中SV具有緩慢的藥物釋放率,9.8%的SV在前3小時(shí)內(nèi)釋放,6天內(nèi)釋放75.55%。兩種復(fù)合材料中SV的釋放與單純SMP和SV體外釋放曲線無(wú)明顯區(qū)別。2.SMP對(duì)兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)效能及特點(diǎn)(1)SMP在兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)大體特征。術(shù)后16只新西蘭大白兔均無(wú)死亡,切口愈合,術(shù)區(qū)無(wú)裂開、無(wú)血腫潰爛、無(wú)感染,飲食、活動(dòng)、體重正常。大體形態(tài)學(xué)觀察可見SMP組顱骨缺損區(qū)被硬組織覆蓋,中央見部分骨粉顆粒,表面尚光滑,厚度均勻,色微紅,與周邊舊骨質(zhì)有明顯骨融合,鈣黃綠素?zé)晒馕锱c新骨結(jié)合顯黃色較多,質(zhì)地較硬。 SV組顱骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成,色灰白,質(zhì)地較硬,中央部略凹陷,較邊緣為薄,邊界模糊,中央見骨粉顆粒有新骨生成,鈣黃綠素?zé)晒馕锱c新骨結(jié)合顯黃色；BS組邊界清,缺損區(qū)可清晰見大量骨粉顆粒,期間有少量新骨生成；BC組骨缺損區(qū)中央局部凹陷,為纖維組織覆蓋,成暗紅色,質(zhì)軟,周邊可見少量新骨形成,邊界清晰可辯。(2)SMP組兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)的影像學(xué)特征。影像學(xué)研究可見SMP組缺損區(qū)域內(nèi)密度最高,可見局部高密度骨島,周邊與正常組織界限模糊；SV組缺損區(qū)內(nèi)密度較BS、BC組高,缺損區(qū)范圍變小,BS、BC組界限清楚,低密度影但可見邊緣密度稍高。CT三維重建圖可見SMP組缺損區(qū)愈合,邊界模糊；SV組缺損區(qū)愈合,邊界尚清楚；BS組缺損區(qū)范圍變小,可見邊緣有新骨形成；BC組缺損區(qū)范圍最大,邊界清楚。SMP組影像學(xué)顯示兔顱骨骨缺損的新骨量較其他三組有明顯增加。(3)SMP組兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損修復(fù)的組織形態(tài)學(xué)特征。在熒光顯微鏡下,四組植骨區(qū)均可見亮綠色熒光帶,在術(shù)后4周內(nèi)新骨形成量比較：SMP組SV組BS組≥BC組。通過(guò)HE染色,鏡下觀察到骨替代材料BioOss(?)間粉紅色和均質(zhì)結(jié)構(gòu),吸收較少。SMP組在缺損區(qū)有明顯的纖維組織和成骨細(xì)胞。BC組缺損主要是纖維和軟組織填充。高倍鏡下觀察,SMP組標(biāo)本顯示：新骨大量形成,組成薄的織物,外周存在不規(guī)則的小梁和成骨細(xì)胞；成骨細(xì)胞的細(xì)胞核染色為紫色,呈多核分裂象如梭形或多角狀,并有多個(gè)突起呈不規(guī)則形狀,表明成骨細(xì)胞處于活躍期。還可見新生骨組織和新生血管,骨小梁多見。(4)SMP組兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)效能。SMP組標(biāo)本中新骨面積比(23.98±1.92%)明顯高于其他三組,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SMP組明顯高于SV組(18.90±1.23%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P0.05,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SV組新成骨面積(18.90±1.23%)顯著高于BS組(8.78±0.43%)和BC組(8.29±1.83%),有顯著性差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P0.05,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BS組的新骨面積比(8.78±0.43%)略高于BC組(8.29±1.83%),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=-0.6170.05,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。馬松三色染色高倍鏡下顯示,SMP組大量新骨膠原纖維和骨礦化的主要成分染成深藍(lán)色,并連接形成骨小梁結(jié)構(gòu)；新生骨膠原纖維染成深藍(lán)色表現(xiàn)相對(duì)成熟,排列整齊；成骨細(xì)胞被類骨質(zhì)包繞形成骨細(xì)胞,形成骨陷窩,有鈣鹽沉積的骨細(xì)胞及骨陷窩結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)藍(lán)染；同時(shí),在骨膠原或骨替代物中可見活性成骨細(xì)胞細(xì)胞核染色呈粉紅色。SMP組新骨膠原纖維明顯多于其他3組。(5)在兔顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)中,SMP對(duì)BMP-2因子表達(dá)的影響在SMP組缺損區(qū)新形成的類質(zhì)骨或骨替代物周圍,明顯可見BMP-2+細(xì)胞。BMP-2+細(xì)胞,細(xì)胞核染成深棕色,呈多核分裂象,如梭形或多角型；SMP組(93.02±7.98%)和SV組(77.63±9.25%)BMP-2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量百分比均明顯高于BC(25.60±5.44%)組和BS(30.60±5.71%)組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P0.05,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SMP組(93.02±7.98%)明顯高于SV組(77.63±9.25%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SV組(77.63±9.25%)高于BC組(25.60±5.44%)和BS組(30.60±5.71%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；BC組(25.60±5.44%)略低于BS組(30.60±5.71%),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=-0.5530.05)。結(jié)論1.改良的載辛伐他汀聚合物納米粒的制備方法簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性高。SMP具有分布均勻、形態(tài)規(guī)整、穩(wěn)定性好、有效的提高辛伐他汀的溶解性、緩慢釋放藥物并持續(xù)維持局部高濃度等特征,可作為SV藥物有效載體,值得推廣應(yīng)用。2.SMP作為SV藥物的有效載體,局部給藥能顯著提高SV局部藥物濃度和持續(xù)作用時(shí)間,SMP是通過(guò)促進(jìn)BMP-2的表達(dá),有效提高骨缺損處的新骨形成效率,加速骨損傷的愈合。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R783.6

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本文編號(hào)：1148318