發(fā)布時間：2017-11-01 05:26

  本文關(guān)鍵詞：載BMP2質(zhì)粒DNA的殼聚糖溫敏水凝膠對牙周膜成纖維細胞相容性的評價

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【摘要】：目的:本項目擬制備物理交聯(lián)殼聚糖-甘油磷酸溫敏水凝膠(CS/α,β-GP)負載含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒CSn(pDNA-BMP2),將其與CS/α,β-GP溫敏水凝膠復(fù)合,構(gòu)建CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合修復(fù)體系。研究該體系對人牙周成纖維細胞(HPDLCs)的細胞相容性。方法:一、載BMP2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒(CSn(pDNA-BMP2))的制備及性質(zhì)檢測:成功構(gòu)建pDNA-BMP2質(zhì)粒表達載體;采用離子交聯(lián)法制備載BMP2質(zhì)粒DNA殼聚糖納米粒CSn(pDNA-BMP2);采用掃描電鏡觀察形態(tài);zeta電位儀測定粒徑、分散度、Zeta電位;應(yīng)用瓊脂凝膠阻滯法分析CSn載體與pDNA-BMP2的結(jié)合能力及電荷性質(zhì);運用酶保護法測定CSn載體對pDNA-BMP2的保護作用。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP體系的構(gòu)建及性質(zhì)檢測:(1)CS/α,β-GP溫敏水凝膠的制備:采用物理交聯(lián)的方法制備CS/α,β-GP溫敏水凝膠;掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài);試管倒置法測定其溫敏性。(2)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP體系的構(gòu)建:取適量的CSn(pDNA-BMP2)磁力攪拌下分散于CS/α,β-GP溫敏水凝膠溶液中,構(gòu)建載CSn(pDNA-BMP2)的CS/α,β-GP溫敏水凝膠體系,即CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系;掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài);試管倒置法測定其溫敏性。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP對HPDLCs細胞相容性的評價:(1)原代培養(yǎng)HPDLCs,并鑒定組織來源。(2)HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系中三維培養(yǎng),觀察細胞形態(tài)及增殖情況。(3)將HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系浸提液中培養(yǎng),CCK8法檢測細胞增殖情況;采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)。結(jié)果:一、CSn(pDNA-BMP2)的制備及性質(zhì)檢測結(jié)果:(1)空白CSn及CSn(pDNA-BMP2)電鏡下觀察,呈球形,粒徑均一;CSn(pDNA-BMP2)粒徑較空白CSn略大。(2)CSn的平均粒徑為170nm,PDI為0.249,Zeta電位為45.5mv。CSn(pDNA-BMP2)平均粒徑為270.1nm,PDI為0.486,Zeta電位為27.0mv。(3)瓊脂凝膠電泳分析顯示,由于中和了質(zhì)粒DNA所帶的負電荷,電泳時質(zhì)粒不出孔,而裸質(zhì)粒pDNA-BMP2出孔,證明CSn能有效地結(jié)合pDNA-BMP2;(4)酶保護實驗顯示,裸質(zhì)粒pDNA-BMP2及N/P為0.5:1的孔內(nèi)顯示空白無條帶,而CSn(pDNA-BMP2)在N/P為1:1、1.5:1、2:1、2.5:1時,則仍為白色。證明CSn(pDNA-BMP2)在N/P為1:1、1.5:1、2:1、2.5:1時,可以有效保護pDNA-BMP2免受酶的降解。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系的構(gòu)建及性質(zhì)檢測結(jié)果:(1)試管倒置法顯示CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系均可在37℃下3 min內(nèi)由可流動的溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢闪鲃拥哪z狀態(tài);(2)掃描電鏡顯示,復(fù)合體系為多孔的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且CSn(pDNA-BMP2)能均勻分散于水凝膠支架的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP對HPDLCs細胞相容性的評價結(jié)果:(1)成功原代培養(yǎng)HPDLCs,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,培養(yǎng)的細胞HPDLCs波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,證明細胞來源于外胚層。(2)結(jié)晶紫染色顯示,HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系中形態(tài)良好,48h后開始擴增。(3)CCK8實驗結(jié)果顯示,不同濃度的CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP溫敏水凝膠復(fù)合體系浸提液在1d和3d時均能促進HPDLCs的增殖,且CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP溫敏水凝膠復(fù)合體系浸提液培養(yǎng)的HPDLCs較CS-α,β-GP溫敏水凝膠浸提液培養(yǎng)的的細胞增殖更快。結(jié)論:(1)CSn具有良好的形態(tài)、粒徑及電位。(2)CSn能有效結(jié)合和保護pDNA-BMP2,CS/CSn(pDNA-BMP2)在N/P為2.5:1時具有最好的形態(tài)、粒徑及電位。(3)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP復(fù)合體系具有溫敏性及大孔徑,促進HPDLCs的生長和增殖,具備良好的細胞相容性。
【關(guān)鍵詞】：骨形成蛋白-2 殼聚糖 殼聚糖納米粒 殼聚糖溫敏水凝膠 人牙周成纖維細胞
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 實驗一 負載骨形成蛋白-2 質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒制備及性質(zhì)檢測11-20
• 1.1 材料與設(shè)備11-12
• 1.2 實驗方法12-14
• 1.3 結(jié)果14-17
• 1.4 討論17-20
• 實驗二 載質(zhì)粒DNA納米粒的殼聚糖溫敏水凝膠復(fù)合體系的構(gòu)建及性質(zhì)檢測20-26
• 2.1 材料與設(shè)備20-21
• 2.2 實驗方法21-22
• 2.3 結(jié)果22-24
• 2.4 討論24-26
• 實驗三 載質(zhì)粒DNA納米粒的殼聚糖溫敏水凝膠復(fù)合體系對牙周膜成纖維細胞相容性的評價26-36
• 3.1 材料與設(shè)備26-27
• 3.2 實驗方法27-29
• 3.3 結(jié)果29-35
• 3.4 討論35-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 綜述41-51
• 參考文獻48-51
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果51-52
• 致謝52-53

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本文編號：1125461