本文關(guān)鍵詞：一個(gè)遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型家系的致病基因研究

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【摘要】：背景與目的遺傳性牙本質(zhì)疾病(Hereditary Dentin Defects)是一種常見(jiàn)的人類牙本質(zhì)遺傳性疾病,主要局限于牙乳頭跟牙齒中胚層發(fā)育異常的一類疾病,其發(fā)病率為1/10000-1/6000。早在1973年,Shields將牙本質(zhì)發(fā)育不全分為兩大類：遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良(Dentin Dysplasia, DD)與牙本質(zhì)發(fā)育不全(Dentinogenesis Imperfect, DGI);5小類(2類牙本質(zhì)發(fā)育不良與3類牙本質(zhì)發(fā)育不全)。本實(shí)驗(yàn)主要研究牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型(DD-Ⅰ)。DD-I (OMIM:125400)是一種罕見(jiàn)的染色體顯性遺傳疾病,外顯率不足100%,發(fā)病率為1/100000[2]。臨床檢查顯示為牙冠形態(tài)、色澤表現(xiàn)正常,牙本質(zhì)形成缺陷和髓腔閉塞,經(jīng)常伴有根尖X線透射。Ballschmiede在1920年對(duì)這種疾病進(jìn)行了相應(yīng)的描述,他將來(lái)自于同一個(gè)家庭的7個(gè)小孩牙齒牙根短鈍、牙齒自然脫落現(xiàn)象稱之為條件性“無(wú)牙根性牙齒”[3]。斑馬魚(yú)的牙齒和人類以及其它哺乳動(dòng)物在結(jié)構(gòu)上類似,擁有牙髓腔、牙本質(zhì)和類牙釉質(zhì)。在牙齒附著期間存在釉器,發(fā)育期和人類牙齒發(fā)育期相似,有蕾狀期、帽狀期、鐘狀期,但斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育周期短、過(guò)程簡(jiǎn)單。在基因調(diào)控方面,斑馬魚(yú)中調(diào)控牙齒發(fā)育的基因大部分在人類中都有相應(yīng)的同源基因,如BMPs、FGF, Alk8、Pitx2a、Dlx, Pax9等多個(gè)基因。另,能譜分析、掃描電鏡比較成年斑馬魚(yú)牙齒與人類16周齡胎兒牙胚的礦化程度和Ca、P比例,發(fā)現(xiàn)兩者相似度極高。在組織和超微結(jié)構(gòu)上,斑馬魚(yú)的牙齒也和人類牙齒相似性很高。因此,選擇斑馬魚(yú)作為牙齒發(fā)育研究的模式生物。目前對(duì)于DD-Ⅰ型的相關(guān)致病基因的研究仍然是個(gè)迷,為解決這一難題,本課題組對(duì)一個(gè)河南鄭州的中國(guó)人家系進(jìn)行了相關(guān)基礎(chǔ)研究。利用連鎖分析、全基因組測(cè)序和sanger測(cè)序等方法證實(shí)VPS4B基因突變導(dǎo)致DD-Ⅰ型疾病,為DD-Ⅰ型疾病診斷提供分子學(xué)依據(jù)。通過(guò)對(duì)VPS4B基因的分析,闡述了VPS4B基因突變的致病機(jī)理。在細(xì)胞水平,利用VPS4B過(guò)表達(dá)與si-RAN敲降實(shí)驗(yàn)對(duì)牙齒發(fā)育相關(guān)經(jīng)典通路-WNT5A經(jīng)典通路中的相關(guān)基因的調(diào)控作用進(jìn)行分析,為以后闡明牙齒發(fā)育機(jī)理提供重要的信息。利用斑馬魚(yú)這一模式生物,以斑馬魚(yú)的牙齒發(fā)育系統(tǒng)作為模型,采用“敲低表達(dá)”和“過(guò)量表達(dá)”的方法結(jié)合"rescue"實(shí)驗(yàn),初步研究了vps4b基因在斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育過(guò)程中的功能作用。材料與方法：1.對(duì)一個(gè)中國(guó)河南鄭州的中國(guó)人DD-Ⅰ家系采用連鎖分析,全基因組外顯子測(cè)序、sanger測(cè)序以及限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證等技術(shù)方法,確定致病基因與突變位點(diǎn)。家系樣本DNA采用酚／氯仿方法提取,RNA使用TRIZOL與試劑盒提取(RNeasy Mini Kit. Qiagen),然后用去gDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA。2.使用高分辨率熔煉曲線(High Resolution Melting, HRM)技術(shù)篩查當(dāng)?shù)厝巳?00份隨機(jī)樣本,確定VPS4B基因IVS7+46CG的突變頻率。3.VPS4B基因的時(shí)空表達(dá)譜：利用RT-PCR確定VPS4B基因在人不同組織、細(xì)胞系以及不同時(shí)期的小鼠腦組織表達(dá)譜。組織與細(xì)胞系總RNA使用TRIZOL提取,然后用去gDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序確定。4.剪切突變驗(yàn)證：設(shè)計(jì)特異的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增引物,利用家系病人與正常人逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA,使用RT-PCR膠圖結(jié)合Sanger測(cè)序確定剪切突變。5.利用Olig7設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物,采用熒光定量PCR技術(shù),檢測(cè)家系中正常人與病人牙齦組織細(xì)胞中VPS4B基因總轉(zhuǎn)錄水平的差異以及病人外牙齦組織細(xì)胞中發(fā)生剪切突變后形成的異常轉(zhuǎn)錄本與正常轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄水平的差異。6.蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),用Swiss-Model.軟件對(duì)野生型與突變型的VPS4B蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),SOPMA對(duì)野生型與突變型的VPS4B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。7.將人類VPS4B基因正常轉(zhuǎn)錄本與異常轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆到載體pcDNA3.1+-FLAG上,然后利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明轉(zhuǎn)染到已培養(yǎng)好的HEK-293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集細(xì)胞,提取總蛋白,利用WestemBlot技術(shù)檢測(cè)野生型蛋白與突變型蛋白之間以及共轉(zhuǎn)后蛋白表達(dá)之間的差異。8.亞細(xì)胞定位：將人類VPS4B基因正常轉(zhuǎn)錄本與異常轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆到載體pEGFP-C1上利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明轉(zhuǎn)染到已培養(yǎng)好的COS7細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用DAPI染核技術(shù)染核,于熒光顯微鏡下觀察拍照,比較野生型蛋白與突變型蛋白在細(xì)胞中表達(dá)部位的差異。9.將人類VPS4B基因正常轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆到載體pcDNA3.1+上,委托廣州銳博生物科技有限公司ribobio合成siRNA-VPS4B序列,分別利用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)好的Human Gingival fibroblasts(HGF)細(xì)胞中,使其過(guò)表達(dá)或表達(dá)降低,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)使用TRIZOL提取RNA,然后用去gDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA,過(guò)表達(dá)試驗(yàn)中pcDNA3.1+空載轉(zhuǎn)染作實(shí)驗(yàn)對(duì)照,敲降試驗(yàn)中使用廣州銳博生物科技有限公司提供的VPS4B-Control轉(zhuǎn)染作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)VPS4B過(guò)表達(dá)與低表達(dá)對(duì)牙齒發(fā)育相關(guān)基因WNT5A、WNT5A受體CHMP4B與WNT5A經(jīng)典信號(hào)通路中β-catenin的轉(zhuǎn)錄水平的影響。10.使用茜素紅染色觀察斑馬魚(yú)牙齒的發(fā)育,用于實(shí)驗(yàn)研究。11.利用NCBI的BLAST在線比對(duì)軟件,搜尋人類VPS4B在斑馬魚(yú)中的同源基因vps4b,并對(duì)它們的相似性進(jìn)行比較分析。12.使用RT-PCR確定斑馬魚(yú)中vps4b基因的表達(dá),設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成斑馬魚(yú)vps4b基因反義RNA探針,使用整體原位雜交技術(shù)分析vps4b基因的時(shí)空表達(dá)譜。13.委托美國(guó)GeneTools公司設(shè)計(jì)并合成兩段針對(duì)該斑馬魚(yú)基因的morpholino oligonucleotides;其中MO-1的作用在于抑制基因的表達(dá)、翻譯,MO-2則能夠干擾轉(zhuǎn)錄本的正常剪切并可能最終得到長(zhǎng)度異常的靶基因轉(zhuǎn)錄本,指導(dǎo)翻譯出長(zhǎng)度及序列異常的蛋白質(zhì)分子。14.將人類VPS4B基因克隆到載體pCS2上,然后用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成該基因的mRNA。15.通過(guò)顯微注射將morpholino和人VPS4B的mRNA分別單獨(dú)以及共同導(dǎo)入斑馬魚(yú)的受精卵；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)人類VPS4B在斑馬魚(yú)中的同源基因在morpholino作用下其mRNA水平的改變。16.顯微注射后觀察魚(yú)卵的生長(zhǎng)發(fā)育情況,并計(jì)數(shù)其中牙齒產(chǎn)生缺陷的胚胎以及正常的胚胎,并計(jì)算缺陷率和牙齒正常的率。17.設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成斑馬魚(yú)早期牙齒發(fā)育相關(guān)基因反義RNA探針,使用整體原位雜交技術(shù)分析斑馬魚(yú)vps4b基因敲降后對(duì)斑馬魚(yú)早期發(fā)育相關(guān)基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a、pitx2表達(dá)的影響。結(jié)果：確定突變位點(diǎn)：通過(guò)對(duì)DD-Ⅰ家系遺傳圖譜分析,該家系DD-Ⅰ遺傳方式為顯性遺傳,進(jìn)一步對(duì)家系成員連鎖分析、全基因組外顯子測(cè)序、直接DNA序列測(cè)定和限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證確定,結(jié)果顯示：位于病人的Chr18q21.2-Chr18q21.33區(qū)域VPS4B基因第7號(hào)內(nèi)含子區(qū)的第46位發(fā)生CG的雜合突變即ⅣS7+46CG, flag:CACT C TGTCG→CACT G TGTCG。突變頻率篩查,選取當(dāng)?shù)厝巳?00份隨機(jī)外周血樣本,DNA提取后采用HRM技術(shù)與測(cè)序分析,結(jié)果顯示：該人群中未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變。VPS4B時(shí)空表達(dá)譜：提取人不同組織以及細(xì)胞系的總RNA,小鼠E7、E11、E15、E17、P1、P3、P7、P10、P15、P16、Adult腦組織不同時(shí)期的總RNA, RT-PCR,結(jié)果顯示：VPS4B基因在人不同組織中以及細(xì)胞系中都有表達(dá),小鼠腦組織的不同時(shí)期均表達(dá)。致病機(jī)理與蛋白功能分析：提取家系正常人與病人牙齦組織細(xì)胞總RNA,設(shè)計(jì)特異的轉(zhuǎn)錄本引物,RT-PCR后膠圖結(jié)合sanger測(cè)序確定,結(jié)果顯示：突變后在VPS4B基因IVS7+46位置形成一個(gè)新的剪切位點(diǎn),從而形成一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本(VPS4B-MUT)。在VPS4B基因轉(zhuǎn)錄形成的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的公共區(qū)域設(shè)計(jì)熒光定量PCR (RTFQ-PCR)引物,取正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8,病人Ⅱ-2、Ⅳ-6 cDNA,采用RTFQ-PCR,結(jié)果顯示：正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8比病人Ⅱ-2、Ⅳ-6牙齦組織細(xì)胞中總轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄水平高(p0.001)。設(shè)計(jì)兩對(duì)特異的RTFQ-PCR引物,使其只能單一擴(kuò)增出正常轉(zhuǎn)錄本(VPS4B-WT)或異常轉(zhuǎn)錄本(VPS4B-MUT),選取病人Ⅱ-2、Ⅳ-4、Ⅲ-7、Ⅳ-5 cDNA,采用RTFQ-PCR,結(jié)果顯示：病人牙齦組織細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平比異常轉(zhuǎn)錄本高(p0.001),異常轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平隨年齡呈增多趨勢(shì)。Wiss-PdbViewer 4.1.0軟件對(duì)野生型與突變型VPS4B蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：突變型與野生型相比較,突變型VPS4B蛋白在無(wú)規(guī)轉(zhuǎn)角區(qū)域插入15aa(264-278位),第132-134位由無(wú)規(guī)轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成β折疊,237-239位無(wú)規(guī)轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成α螺旋。SOPMA對(duì)野生型與突變型的VPS4B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：兩者除了在氨基酸序列長(zhǎng)度上改變,還使250AA之后的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；突變型與野生型相比,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和β折疊區(qū)域均比例降低了,無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域則增加了約3%。構(gòu)建好的pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-WT與pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-MUT表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染,以及共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后,WesternBlot結(jié)果顯示：VPS4B野生型蛋白表達(dá)水平比突變型蛋白水平高,共轉(zhuǎn)的兩種蛋白總表達(dá)水平比突變型蛋白高。構(gòu)建好的pEGFP-C1-VPS4B-WT載體與pEGFP-C1-VPS4B-MUT載體分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)DAPI染色,結(jié)果顯示：VPS4B-WT蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá),VPS4B-MUT細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá),只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。pcDNA3.1+-VPS4B-WT表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HGF細(xì)胞過(guò)表達(dá)與siRNA-VPS4B轉(zhuǎn)染HGF細(xì)胞敲降實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示：VPS4B過(guò)表達(dá)使CHMP4B、WNT5A與B-catenin表達(dá)量升高,VPS4B敲降后使CHMP4B、WNT5A與β-catenin表達(dá)量降低。人類vps4b基因與斑馬魚(yú)中vps4b基因蛋白具有88%同源性,cDNA序列75%同源。提取斑馬魚(yú)1-5dpf的總RNA, RT-PCR,結(jié)果顯示：vps4b在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期有表達(dá),進(jìn)一步確定它們?cè)谂咛ブ械谋磉_(dá)部位,不同發(fā)育時(shí)期的胚胎整體原位雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示：vps4b在斑馬魚(yú)腮弓處表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成vps4b morpholino,顯微注射后結(jié)果顯示：注射vps4b的morpholino后可引起斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育異常vps4b-MO與人VPS4B mRNA共注射結(jié)果顯示異�？杀蝗艘吧偷膙ps4b mRNA顯微注射挽救。單獨(dú)注射vps4b mRNA后斑馬魚(yú)牙齒的發(fā)育沒(méi)有明顯影響。注射vps4b的morpholino后,結(jié)果顯示：斑馬魚(yú)早期牙齒發(fā)育相關(guān)基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a表達(dá)降低,pitx2表達(dá)部位發(fā)生改變,由兩側(cè)向中間聚集。結(jié)論：通過(guò)對(duì)DD-Ⅰ家系人員基因組的外顯子測(cè)序、STR連鎖分析等幾種不同方法分析,發(fā)現(xiàn)一種世界首報(bào)的VPS4B突變IVS7+46CG,成功闡明該突變?yōu)橐环N深度內(nèi)含子區(qū)的剪切突變。利用RT-PCR展現(xiàn)了VPS4B在人的不同組織細(xì)胞系以及老鼠不同時(shí)期的腦組織的穩(wěn)定表達(dá),確定了VPS4B的時(shí)空表達(dá)譜—廣泛表達(dá)；在牙齦與下頜組織中的表達(dá),表明VPS4B基因與人的牙齒發(fā)育密切相關(guān)。在DD-Ⅰ家系中,RTFQ-PCR檢測(cè),正常人牙齦組織中VPS4B總轉(zhuǎn)錄水平較病人高,病人牙齦組織細(xì)胞中VPS4B正常轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄水平較異常轉(zhuǎn)錄本高,且隨年齡的增長(zhǎng)呈增多的趨勢(shì),該病病情可能與年齡存在一定關(guān)系。通過(guò)軟件對(duì)野生型蛋白與突變型蛋白三維空間結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)突變型蛋白三維空間結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)較野生型蛋白發(fā)生較大的改變。通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù),確定野生型蛋白在細(xì)胞胞質(zhì)、胞核都表達(dá),突變型蛋白只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。另外突變型蛋白在體外細(xì)胞中表達(dá)水平較野生型蛋白、共轉(zhuǎn)蛋白低,分子量比野生型蛋白大1.7KDa,說(shuō)明該蛋白在患者體內(nèi)能穩(wěn)定存在。整個(gè)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平的變化提示導(dǎo)致牙齒缺陷的機(jī)制可能為單倍型劑量不足。通過(guò)在Human Gingival fibroblasts(HGF)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)與敲降實(shí)驗(yàn),VPS4B基因與CHMP4B結(jié)合,促進(jìn)WNT5A表達(dá),抑制GSK3β促進(jìn)β-catenin磷酸化,進(jìn)而通過(guò)β-catenin調(diào)節(jié)牙齒相關(guān)基因的表達(dá),調(diào)節(jié)牙齒的發(fā)育。提示VPS4B基因通過(guò)牙齒發(fā)育相關(guān)通路WNT5A經(jīng)典信號(hào)通路影響牙齒發(fā)育。利用RT-PCR證實(shí)人類VPS4B在斑馬魚(yú)中的同源基因vps4b在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期即有表達(dá)；通過(guò)原位雜交確定了vps4b在斑馬魚(yú)的鰓弓處有表達(dá),而斑馬魚(yú)作為硬骨魚(yú)的一種,口腔中沒(méi)有牙齒,而是在第5鰓弓上長(zhǎng)有咽齒。原位雜交的結(jié)果表明vps4b可能在斑馬魚(yú)的牙齒發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。vps4b的反義morpholino寡聚核苷酸注射后引起斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育缺陷,其中vps4b-MO2在斑馬魚(yú)胚胎中可降低與人類vps4b同源的基因Vps4b的正常mRNA水平,產(chǎn)生了部分大小異常的mRNA。Rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：人類野生VPS4B mRNA可達(dá)到拯救vps4b-MO1和vps4b-MO2導(dǎo)致的牙齒缺陷的效果。這進(jìn)一步證明了,人類VPS4B基因在斑馬魚(yú)中的同源基因vps4b在斑馬魚(yú)的牙齒發(fā)育過(guò)程中可能起到關(guān)鍵作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：vps4b的反義morpholino寡聚核苷酸注射后使斑馬魚(yú)牙齒早期發(fā)育相關(guān)基因dlx2b、bmp2a、wnt5a、hoxb5a表達(dá)降低,pitx2表達(dá)部位發(fā)生改變,提示vps4b基因參與牙齒發(fā)育調(diào)控途徑。過(guò)量表達(dá)人野生VPS4B mRNA和突變VPS4B mRNA對(duì)斑馬魚(yú)牙齒的發(fā)育沒(méi)有明顯影響,表明,該基因?qū)е卵例X缺陷的機(jī)制可能為單倍型劑量不足。
【關(guān)鍵詞】：DD-Ⅰ VPS4B基因 基因定位 基因克隆 功能研究
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781;Q78
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第1章 引言22-30
• 1.1 牙本質(zhì)發(fā)育異常的分類及DD-Ⅰ主要特征22-23
• 1.2 DD-Ⅰ型疾病的致病基因23
• 1.3 牙齒的發(fā)育過(guò)程與機(jī)制23-25
• 1.4 VPS4B與牙齒發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)通路—WNT經(jīng)典通路之間的關(guān)系25
• 1.5 牙齒發(fā)育研究模式生物—斑馬魚(yú)25-30
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料30-37
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.2 分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)31-32
• 2.3 相關(guān)試劑32-34
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34-37
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法37-59
• 3.1 DD-Ⅰ家系(見(jiàn)圖4-3)37
• 3.2 技術(shù)路線圖37-38
• 3.3 酚/氯仿法提取外周血基因組DNA38-39
• 3.4 確定突變位點(diǎn)39-40
• 3.5 人群篩查40-41
• 3.6 RNA提取41-42
• 3.7 RNA反轉(zhuǎn)錄42-43
• 3.8 基因轉(zhuǎn)錄本分析43
• 3.9 構(gòu)建VPS4B表達(dá)載體43-45
• 3.10 RT-PCR檢測(cè)VPS4B基因時(shí)空表達(dá)45-46
• 3.11 細(xì)胞培養(yǎng)和VPS4B突變體功能分析46-52
• 3.12 觀察斑馬魚(yú)牙齒的發(fā)育-茜素紅染色52-53
• 3.13 RT-PCR檢測(cè)同源基因在斑馬魚(yú)中的表達(dá)53
• 3.14 顯微注射53-54
• 3.15 原位雜交54-57
• 3.16 體外合成VPS4B基因mRNA57-58
• 3.17 MO合成58-59
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-81
• 4.1 DD-Ⅰ家系臨床表型59-61
• 4.2 連鎖分析與突變位點(diǎn)確定61-63
• 4.3 人群突變頻率篩查63-64
• 4.4 酶切鑒定分析64-65
• 4.5 基因特異性轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)65-66
• 4.6 VPS4B基因時(shí)空表達(dá)譜66-67
• 4.7 VPS4B突變體生物信息預(yù)測(cè)67-68
• 4.8 VPS4B牙齦組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)68-69
• 4.9 VPS4B細(xì)胞定位69-70
• 4.10 VPS4B蛋白表達(dá)水平70-71
• 4.11 VPS4B結(jié)合CHMP4B對(duì)WNT5A經(jīng)典通路的影響71-73
• 4.12 RT-PCR與整體原位雜交檢測(cè)vps4b基因表達(dá)73-74
• 4.13 vps4b敲低表達(dá)后對(duì)斑馬魚(yú)早期牙齒發(fā)育的影響74-76
• 4.14 VPS4B拯救與過(guò)表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)早期牙齒發(fā)育的影響76-78
• 4.15 vps4b敲低表達(dá)后對(duì)斑馬魚(yú)早期牙齒發(fā)育相關(guān)基因的影響78-81
• 第5章 分析與討論81-87
• 5.1 VPS4B突變體的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證81-82
• 5.2 深度內(nèi)含子區(qū)剪切突變驗(yàn)證82
• 5.3 VPS4B對(duì)牙齒發(fā)育的影響82-84
• 5.4 斑馬魚(yú)為模式生物來(lái)研究VPS4B基因84-86
• 5.5 不足與展望86-87
• 參考文獻(xiàn)87-91
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表論文91-92
• 致謝92-94
• 英文縮略詞表94-96

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本文編號(hào)：1122686