發(fā)布時間：2017-10-26 08:14

  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用GelMA水凝膠構(gòu)建牙周膜干細胞力學(xué)三維微環(huán)境及牙周組織再生的實驗研究

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【摘要】：【背景與目的】通過組織工程技術(shù)實現(xiàn)牙周組織的再生、以修復(fù)由各種原因所造成的牙周組織缺損,是牙周病治療的終極目標(biāo)。支架材料在能夠最大化細胞治療療效的同時,提高移植成功率、改善新生組織機械強度及控制細胞/生長因子的釋放,是牙周再生研究中的關(guān)鍵問題。水凝膠(hydrogels)是一種由親水性集團相互交聯(lián)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)支架材料,因其與細胞外基質(zhì)(ECM)有諸多相似性,能夠良好的支持那些附著于其表面、或包裹于其中的細胞的各種生物學(xué)行為,因而已被廣泛用于牙周組織工程支架的研究。近年來開發(fā)的一種新型的光敏水凝膠材料—甲基丙烯酸酐化明膠(Gel MA)得到了學(xué)者們的廣泛青睞,其優(yōu)點包括:結(jié)構(gòu)上具有細胞粘附位點及基質(zhì)金屬蛋白酶水解位點,故可良好支持細胞的增殖及遷徙;甲基丙烯酸酐基團的存在使其具有光敏性,能夠在紫外光照射下快速交聯(lián);理化性能靈活可調(diào);能夠通過諸多微制造工藝,如生物打印、光刻技術(shù)、自組裝、微流體技術(shù)等,制造出具有獨特形貌特點的結(jié)構(gòu)單元等。Gel MA水凝膠已被證明在骨、軟骨、心肌、血管等組織再生方面的獨特優(yōu)勢,并且在基礎(chǔ)細胞研究、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物/基因控釋及生物感應(yīng)等領(lǐng)域亦取得了較好的結(jié)果。另外,牙周組織作為牙齒的支持結(jié)構(gòu)單元,始終處于活躍的力學(xué)微環(huán)境中。大量研究報道了外部力學(xué)刺激與牙周膜生理、病理過程的聯(lián)系。研究指出,適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可以促進(干)細胞活性及增殖,并可通過改變干細胞所處力學(xué)微環(huán)境達到控制干細胞定向分化的目的。由此可見,深入理解牙周膜細胞與其所處力學(xué)微環(huán)境的相互作用機理,找出牙周膜細胞的最適力學(xué)參數(shù),必將有助于實現(xiàn)牙周組織再生。本研究旨在:(1)制備表征Gel MA水凝膠,遴選出最適宜人牙周膜干細胞(h PDLSCs)生長繁殖的各項理化參數(shù);(2)基于Gel MA水凝膠的光敏性,開發(fā)出個體化三維力學(xué)加載生物反應(yīng)器,并通過此設(shè)備對h PDLSCs進行三維拉伸加載,研究在三維條件下不同應(yīng)變及頻率對細胞活性及增殖狀態(tài)的影響;(3)以Gel MA水凝膠及n HA為主要組分,通過凍干技術(shù)制備Gel MA/n HA復(fù)合水凝膠支架材料,載入h PDLSCs后,對其體外增殖、分化,以及體內(nèi)組織再生情況進行探索。【方法】1.首先按照前人經(jīng)驗制備并合成Gel MA水凝膠前體;場發(fā)射電子掃描顯微鏡觀察不同單體濃度Gel MA水凝膠表面形貌,并測定材料孔隙率及孔徑;Instron萬能試驗機檢測不同單體濃度水凝膠的楊氏模量及溶脹比;隨后應(yīng)用微光刻技術(shù)制備Gel MA微凝膠陣列;原代分離并培養(yǎng)h PLDSCs,而后將其包裹于Gel MA微凝膠陣列中;通過免疫熒光染色技術(shù)比較了不同單體濃度及紫外光照時間對h PLDSCs活性的影響。2.基于Gel MA水凝膠的光敏特性,通過直流微型電機、直線導(dǎo)軌、偏心凸輪、有機玻璃板等結(jié)構(gòu)機械制造、組裝個體化力學(xué)三維加載生物反應(yīng)器;應(yīng)用此個體化三維力學(xué)加載生物反應(yīng)器對包裹于Gel MA微凝膠陣列中的h PDLSCs進行不同頻率及應(yīng)變的三維拉伸實驗,觀察細胞的活性及增殖情況。3.將不同濃度n HA與Gel MA單體混合后,通過凍干技術(shù)制備出一系列濃度配比的Gel MA/n HA復(fù)合水凝膠支架材料;Instron萬能試驗機檢測其楊氏模量;SEM觀察其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu);將h PDLSCs載入支架中,采用MTT檢測細胞活性,Brd U摻入法檢測細胞增殖,茜素紅染色及RT-PCR檢測細胞的分化;隨后將載有h PDLSCs的復(fù)合凝膠支架材料植入裸鼠皮下進行體內(nèi)試驗,應(yīng)用HE染色、馬松三色染色以及SEM觀察樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu),評估其體內(nèi)組織再生能力�！窘Y(jié)果】1.成功制備出Gel MA水凝膠白色泡沫狀單體,在UV及光引發(fā)劑的條件能夠快速交聯(lián),并成功制備出Gel MA水凝膠微陣列。FE-SEM觀察Gel MA水凝膠支架表面形貌可見表面平滑連續(xù)、孔徑均一、相互連通的多孔三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。隨著單體濃度的增加,其機械性能(楊氏模量)亦增加,而溶脹比、孔徑、及孔隙率卻相應(yīng)的降低。成功原代分離培養(yǎng)出h PDLSCs,將其包裹于Gel MA水凝膠三維培養(yǎng)一定天數(shù)后發(fā)現(xiàn),增加UV光照時間會顯著降低細胞活性,而不同Gel MA單體濃度對細胞活性無顯著性影響。2.成功構(gòu)建出個體化力學(xué)三維加載生物反應(yīng)器,能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞進行不同應(yīng)變、不同頻率的三維拉伸加載等功能。通過比較不同應(yīng)變、不同頻率加載方式對h PDLSCs的影響,我們發(fā)現(xiàn)5%應(yīng)變量的靜態(tài)拉伸能夠顯著提高凝膠內(nèi)細胞活力,促進細胞增殖;而不同頻率的動態(tài)拉伸則對細胞的活力、增殖無明顯影響。3.成功制備了5%及10%兩種不同單體濃度的Gel MA/n HA水凝膠復(fù)合支架材料,每一種包含n HA濃度依次為1%、5%、10%。SEM觀察可見n HA團塊具有較好的分散性,表明n HA與Gel MA凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)合良好;隨著Gel MA單體濃度的升高,水凝膠支架的孔徑會顯著下降。Gel MA單體濃度的提高會顯著增強水凝膠支架的剛度特性,且n HA含量的增高亦會增大復(fù)合水凝膠支架的楊氏模量。MTT和Brd U摻入實驗結(jié)果表明,n HA的混入對細胞活性沒有顯著影響,但卻影響了細胞的增殖能力。隨后,茜素紅染色和RT-PCR結(jié)果表明,未混入n HA的Gel MA水凝膠支架中的細胞基本不會向成骨細胞分化,而混入n HA的支架材料顯著促進了h PDLSCs的成骨分化能力。從成骨分化標(biāo)志基因的表達亦可看出,當(dāng)n HA含量為5%w/v時,h PDLSCs的分化能力最為活躍。裸鼠體內(nèi)試驗結(jié)果表明,Gel MA/n HA復(fù)合凝膠支架在局部沒有引發(fā)炎性反應(yīng),說明具有較好的生物安全性;HE及馬松三色染色結(jié)果均提示樣本內(nèi)部發(fā)生了不同程度的礦化反應(yīng),其中5%n HA組可見粗大的新生骨基質(zhì)貫通整個樣本內(nèi)部;SEM結(jié)果表明,隨著n HA含量的增加,樣品內(nèi)部礦化程度亦隨之增加。在各組樣本中均可觀察到h PDLSCs粘附于支架上,對照組、1%及5%組樣本中亦可見大量毛細血管及RBC,提示n HA具有一定的誘血管生成作用。【結(jié)論】光敏水凝膠Gel MA是一種理想的軟物質(zhì)生物材料,具有良好的生物安全性、相容性、可降解性,其理化性能簡易可調(diào),能夠良好地支持h PLDSCs在其中的三維生長。基于Gel MA水凝膠光敏特性開發(fā)出的個體化力學(xué)三維加載生物反應(yīng)器具有行程可控、路徑垂直、高通量、易重復(fù)等優(yōu)點;因其能夠在微納米尺度對三維培養(yǎng)的細胞進行高通量的加載和觀察,領(lǐng)先國內(nèi)外同類加載模型,適宜今后開展三維水平的細胞生物力學(xué)研究。Gel MA/n HA復(fù)合水凝膠支架材料具有良好的生物相容性及一定的促進h PDLSCs礦化分化以及粗血管再生的作用,能夠作為今后牙周再生研究領(lǐng)域的備選支架。
【關(guān)鍵詞】：水凝膠 甲基丙烯酸酐化明膠 人牙周膜干細胞 力學(xué)微環(huán)境 牙周組織再生
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-34
• 第一部分 GelMA水凝膠的制備表征及最優(yōu)參數(shù)的篩選34-50
• 實驗一 GelMA水凝膠的合成及表征34-42
• 1 引言34-35
• 2 材料35-36
• 3 方法36-37
• 4 結(jié)果37-40
• 5 討論40-42
• 實驗二 GelMA水凝膠生物性能檢測42-49
• 1 引言42
• 2 材料42-43
• 3 方法43-45
• 4 結(jié)果45-47
• 5 討論47-49
• 小結(jié)49-50
• 第二部分 牙周膜干細胞力學(xué)三維微環(huán)境的構(gòu)建50-67
• 實驗一 個體化力學(xué)三維加載生物反應(yīng)器的構(gòu)建50-58
• 1 引言50-51
• 2 材料51
• 3 方法51-53
• 4 結(jié)果53-56
• 5 討論56-58
• 實驗二 基于個體化三維加載生物反應(yīng)器的hPDLSCs力學(xué)微環(huán)境構(gòu)建58-66
• 1 引言58
• 2 材料58-59
• 3 方法59-61
• 4 結(jié)果61-65
• 5 討論65-66
• 小結(jié)66-67
• 第三部分 基于GelMA水凝膠及納米羥基磷灰石的牙周組織再生67-92
• 實驗一 GelMA/nHA復(fù)合水凝膠支架材料的制備及表征68-74
• 1 引言68
• 2 材料68-69
• 3 方法69
• 4 結(jié)果69-72
• 5 討論72-74
• 實驗二 GelMA/nHA復(fù)合水凝膠支架材料的體外細胞實驗74-82
• 1 引言74
• 2 材料74-75
• 3 方法75-78
• 4 結(jié)果78-80
• 5 討論80-82
• 實驗三 GelMA/nHA復(fù)合水凝膠支架材料的裸鼠體內(nèi)再生實驗82-91
• 1 引言82
• 2 材料82-83
• 3 方法83-85
• 4 結(jié)果85-89
• 5 討論89-91
• 小結(jié)91-92
• 全文總結(jié)92-93
• 參考文獻93-104
• 個人簡歷和研究成果104-105
• 致謝105-106

【相似文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳f^;應(yīng)用GelMA水凝膠構(gòu)建牙周膜干細胞力學(xué)三維微環(huán)境及牙周組織再生的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

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本文編號：1097797