本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中差異表達(dá)的研究

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【摘要】：頜面部骨缺損主要由外傷、腫瘤、先天畸形等引起,它不僅會(huì)造成顏面畸形,還可引起語言、咀嚼、呼吸等功能障礙,對(duì)患者的生理和心理等各方面都會(huì)造成不良的影響。因此如何在修復(fù)骨缺損的同時(shí)兼顧功能與美觀,是人們不斷研究改進(jìn)的目標(biāo)。傳統(tǒng)的骨缺損修復(fù)方法有人工骨移植、自體骨移植、同種異體骨移植等,然而這些方法都有各自的弊端。為克服這些弊端而構(gòu)建的組織工程骨為骨缺損的修復(fù)提供了一個(gè)新的方法。骨組織工程主要由種子細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)材料以及生長和分化因子這三個(gè)基本的生物學(xué)因素構(gòu)成,其中最基本、最核心的就是種子細(xì)胞的選擇,它是組織工程活性成分的主要來源。骨組織工程中理想的種子細(xì)胞必須具備可以定向分化為成骨細(xì)胞的能力,而且應(yīng)來源廣泛,取材方便,對(duì)機(jī)體損傷小并且移植后免疫排斥反應(yīng)輕。目前,應(yīng)用最廣泛的是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs),其具有較強(qiáng)的成骨分化潛能,源于自體,取材方便,自我更新能力強(qiáng),而且進(jìn)行移植時(shí)不存在免疫排斥反應(yīng)。因此,進(jìn)一步研究MSCs的成骨分化機(jī)制將有助于hMSCs在骨組織工程中的臨床應(yīng)用。目前,對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子調(diào)控機(jī)制的研究已經(jīng)有了顯著的進(jìn)展,其受多種因素調(diào)控,如生長因子(Wnt家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族)、轉(zhuǎn)錄因子(β-catenin、Runx2)和miRNA等。而最近的研究發(fā)現(xiàn)一種新的DNA序列以外的調(diào)控機(jī)制即長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)也影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子,它們并不直接參與蛋白質(zhì)的編碼,起初一直被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的”噪音”,是轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,并不具備生物學(xué)功能。但是近年來,隨著基因芯片技術(shù)及RNA測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,越來越多的lncRNA被鑒定出來,并通過研究證實(shí)其具有復(fù)雜的生物學(xué)功能,在多個(gè)層面上參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等重要生命過程的調(diào)控。如研究顯示lncRNA與神經(jīng)元分化、肌分化、表皮分化、成脂分化等相關(guān)。雖然近年來對(duì)于lncRNA調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究也有少量報(bào)道,但是截至目前,對(duì)于hMSCs成骨分化過程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜特征尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究將首次采用人類lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)在hMSCs成骨分化前后發(fā)生差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行篩選,并對(duì)其進(jìn)行分析研究,為hMSCs成骨分化機(jī)制研究提供新的lncRNA靶點(diǎn),從而為構(gòu)建更理想的組織工程骨移植物提供新的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將分為以下3個(gè)部分：第一章入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定研究目的：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞,在體外分裂增殖能力強(qiáng),可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等,被認(rèn)為是骨組織工程中重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并利用間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基使其向成骨細(xì)胞方向分化后進(jìn)行成骨分化鑒定,為后續(xù)lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。研究方法：1.將購買的原代hMSCs進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)至P2代,并將P2代hMSCs在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7、14、21天后,對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。2.以hMSCs成骨誘導(dǎo)分化7天、14天、21天后的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(分別記為D7、D14和D21),以成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs作為對(duì)照組(記為DO)。通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素紅染色進(jìn)行成骨分化的鑒定。3.對(duì)D0、D7、D14及D21組細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取,然后對(duì)樣本RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定。4.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)檢測(cè)成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix、ALP、 OPN)表達(dá)情況來進(jìn)行成骨分化的鑒定。研究結(jié)果：1.原代hMSCs傳代培養(yǎng)至P2代,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,呈形態(tài)均一的長梭形。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,細(xì)胞增殖加快,7天時(shí)可見細(xì)胞聚集成團(tuán),誘導(dǎo)14天及21天時(shí)可見到棕黑色的鈣結(jié)節(jié)。2.P2代hMSCs進(jìn)行ALP染色及茜素紅染色,結(jié)果均為陰性。將成骨誘導(dǎo)7、14、21天后的細(xì)胞行ALP染色,胞質(zhì)中呈現(xiàn)紅色,提示ALP染色結(jié)果為陽性；行茜素紅染色,可見紅色的鈣鹽沉積,提示茜素紅染色結(jié)果為陽性。3.D0、D7、D14、D21樣本RNA的A260/A280值均為1.8-2.0,說明總RNA具有較高的純度；RNA完整性：經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測(cè),RNA樣品電泳條帶清晰,28S：18S rRNA條帶亮度大于或接近2：1,質(zhì)量符合進(jìn)一步RT-PCR實(shí)驗(yàn)及后續(xù)表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。4.RT-PCR檢測(cè)hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后Osterix、ALP、OPN的表達(dá)變化,結(jié)果顯示與hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前相比,成骨誘導(dǎo)分化后Osterix、ALP、OPN的表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二章人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA的篩選及驗(yàn)證研究目的：本實(shí)驗(yàn)通過lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù)篩選出hMSCs成骨分化前后差異表達(dá)的lncRNA表達(dá)譜特征,初步探討了lncRNA在hMSCs成骨分化過程中的重要作用。但是基因芯片檢測(cè)存在一定的假陽性率,必須通過其他的方式加以驗(yàn)證,因此我們從芯片檢測(cè)結(jié)果中隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)lncRNA(2個(gè)上調(diào)的lncRNA:ENST00000523786.1和ENST00000436715.1,3個(gè)下調(diào)的IncRNA: ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),以進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究方法：1.D0、D7、D14及D21組細(xì)胞樣本RNA質(zhì)檢合格后,進(jìn)行體外擴(kuò)增和熒光標(biāo)記,將標(biāo)記后的產(chǎn)物與Agilent公司人IncRNA V3.0芯片雜交過夜。使用Agilent芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描,得到雜交圖片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)(包括IncRNA及mRNA數(shù)據(jù))。然后使用Agilent GeneSpring軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析(設(shè)定差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change不低于2倍)。2.隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)IncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果：1.芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs相比,成骨誘導(dǎo)分化7天、14天、21天后表達(dá)上調(diào)超過2倍的IncRNA分別有923條、1393條、1338條；下調(diào)超過2倍的IncRNA分別有993條、3843條、3688條；表達(dá)上調(diào)超過2倍的mRNA分別有1462條、4093條、3354條；下調(diào)超過2倍的mRNA分別有953條、2236條、1923條。與成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs相比,成骨誘導(dǎo)分化7、14、21天過程中持續(xù)表達(dá)上調(diào)超過2倍的IncRNA有433條,下調(diào)超過2倍的IncRNA有232條；持續(xù)表達(dá)上調(diào)超過2倍的mRNA有956條,下調(diào)超過2倍的mRNA有229條。2.RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示與DO組相比,ENST00000523786.1和ENST00000436715.1在D7、D14、D21組中表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)；ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2在D7、D14、D21組中表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。第三章人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA和mRNA的生物信息學(xué)分析研究目的：初步探討hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)的mRNA可能與哪些基因功能和生物學(xué)通路的改變相關(guān)。并對(duì)芯片篩選結(jié)果中表達(dá)差異較大的lncRNA附近300 kb區(qū)域蛋白編碼基因進(jìn)行分析,從而預(yù)測(cè)lncRNA作用的靶基因,這將有助于揭示一個(gè)新的受特定lncRNA分子調(diào)控的hMSCs成骨分化機(jī)制。研究方法：對(duì)hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology, GO)和KEGG生物學(xué)通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway analysis)。并選取芯片篩選結(jié)果中表達(dá)差異較大的lncRNA,根據(jù)其序列信息并結(jié)合芯片檢測(cè)結(jié)果中差異表達(dá)mRNA序列信息,對(duì)選取的lncRNA附近300 kb區(qū)域蛋白編碼基因進(jìn)行分析。研究結(jié)果：1.GO分析結(jié)果顯示：在生物學(xué)進(jìn)程(biological process, BP)方面,1MSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有680個(gè)基因富集于生物學(xué)進(jìn)程,其中富集評(píng)分最高的是system development這一生物學(xué)進(jìn)程,含有差異表達(dá)基因217個(gè)。在細(xì)胞組件(cellular component, CC)方面,hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有702個(gè)基因富集于細(xì)胞組件,其中富集評(píng)分最高的是extracellular matrix這一細(xì)胞組件,含有差異表達(dá)基因57個(gè)。在分子功能(molecular function, MF)方面,hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有631個(gè)基因富集于分子功能,其中富集評(píng)分最高的是carbohydrate derivative binding這一分子功能,含有差異表達(dá)基因28個(gè)。2.KEGG分析結(jié)果顯示：MSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有427個(gè)基因富集于生物學(xué)通路,并主要富集于31個(gè)生物學(xué)通路,其中富集評(píng)分最高的是Complement and coagulation cascades這一生物學(xué)通路,含有差異表達(dá)基因21個(gè)。3.我們從芯片篩選結(jié)果中選取hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)表達(dá)上調(diào)較大的lncRNA ENST00000585537.1及下調(diào)較大的lncRNA eHIT000015952,結(jié)合芯片篩選出的差異表達(dá)mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)：lncRNA ENST00000585537.1位于第17號(hào)染色體,在其附近300kb區(qū)域內(nèi)存在3個(gè)蛋白編碼基因(MAP2K6、 TEKT1、ABCA5); lncRNA eHIT000015952位于第3號(hào)染色體,在其附近300kb區(qū)域內(nèi)存在7個(gè)蛋白編碼基因(如PAK2、MFI2、DLG1等)。全文結(jié)論：1.hMSCs在體外具有較強(qiáng)的成骨分化能力,在適當(dāng)培養(yǎng)條件下可分化為成骨細(xì)胞。2.首次通過高通量lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù)篩選出hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后差異表達(dá)lncRNA的表達(dá)譜特征,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)部分差異表達(dá)lncRNA予以驗(yàn)證,證實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。3.GO分析：hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有680個(gè)基因富集于生物學(xué)進(jìn)程,有702個(gè)基因富集于細(xì)胞組件,有631個(gè)基因富集于分子功能。KEGG分析：hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有427個(gè)基因富集于生物學(xué)通路,并主要富集于31個(gè)生物學(xué)通路。4.對(duì)部分差異表達(dá)lncRNA近蛋白編碼基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,提示差異表達(dá)的lncRNA在hMSCs成骨分化過程中可能作用的靶基因。5.為研究hMSCs成骨分化提供新的lncRNA靶點(diǎn),從而為構(gòu)建更理想的組織工程骨移植物提供新的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 長鏈非編碼RNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R782.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 第一章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定23-40
• 1 材料和方法23-32
• 2 統(tǒng)計(jì)方法32
• 3 結(jié)果32-38
• 4 討論38-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第二章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA的篩選及驗(yàn)證40-69
• 1 材料和方法40-47
• 2 統(tǒng)計(jì)方法47
• 3 結(jié)果47-65
• 4 討論65-68
• 5 小結(jié)68-69
• 第三章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA和mRNA的生物信息學(xué)分析69-84
• 1 材料和方法69-71
• 2 結(jié)果71-79
• 3 討論79-83
• 4 小結(jié)83-84
• 全文小結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-91
• 成果91-92
• 致謝92-93

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張科強(qiáng);劉一;王寶剛;羅揚(yáng);;體外沖擊波誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中c-fos、c-jun的表達(dá)[J];山東醫(yī)藥;2008年04期

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本文編號(hào)：1094375