本文關鍵詞：長鏈非編碼RNA在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中差異表達的研究

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【摘要】：頜面部骨缺損主要由外傷、腫瘤、先天畸形等引起,它不僅會造成顏面畸形,還可引起語言、咀嚼、呼吸等功能障礙,對患者的生理和心理等各方面都會造成不良的影響。因此如何在修復骨缺損的同時兼顧功能與美觀,是人們不斷研究改進的目標。傳統(tǒng)的骨缺損修復方法有人工骨移植、自體骨移植、同種異體骨移植等,然而這些方法都有各自的弊端。為克服這些弊端而構建的組織工程骨為骨缺損的修復提供了一個新的方法。骨組織工程主要由種子細胞、細胞外基質(zhì)材料以及生長和分化因子這三個基本的生物學因素構成,其中最基本、最核心的就是種子細胞的選擇,它是組織工程活性成分的主要來源。骨組織工程中理想的種子細胞必須具備可以定向分化為成骨細胞的能力,而且應來源廣泛,取材方便,對機體損傷小并且移植后免疫排斥反應輕。目前,應用最廣泛的是人骨髓間充質(zhì)干細胞(human marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs),其具有較強的成骨分化潛能,源于自體,取材方便,自我更新能力強,而且進行移植時不存在免疫排斥反應。因此,進一步研究MSCs的成骨分化機制將有助于hMSCs在骨組織工程中的臨床應用。目前,對間充質(zhì)干細胞成骨分化的分子調(diào)控機制的研究已經(jīng)有了顯著的進展,其受多種因素調(diào)控,如生長因子(Wnt家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族)、轉(zhuǎn)錄因子(β-catenin、Runx2)和miRNA等。而最近的研究發(fā)現(xiàn)一種新的DNA序列以外的調(diào)控機制即長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)也影響間充質(zhì)干細胞的成骨分化。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子,它們并不直接參與蛋白質(zhì)的編碼,起初一直被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的”噪音”,是轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,并不具備生物學功能。但是近年來,隨著基因芯片技術及RNA測序技術的廣泛應用,越來越多的lncRNA被鑒定出來,并通過研究證實其具有復雜的生物學功能,在多個層面上參與細胞分化和個體發(fā)育等重要生命過程的調(diào)控。如研究顯示lncRNA與神經(jīng)元分化、肌分化、表皮分化、成脂分化等相關。雖然近年來對于lncRNA調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究也有少量報道,但是截至目前,對于hMSCs成骨分化過程中l(wèi)ncRNA的表達譜特征尚無文獻報道。因此,本研究將首次采用人類lncRNA表達譜芯片檢測技術對在hMSCs成骨分化前后發(fā)生差異表達的lncRNA進行篩選,并對其進行分析研究,為hMSCs成骨分化機制研究提供新的lncRNA靶點,從而為構建更理想的組織工程骨移植物提供新的理論基礎。本實驗將分為以下3個部分：第一章入骨髓間充質(zhì)干細胞與成骨誘導分化細胞的培養(yǎng)及鑒定研究目的：人骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞,在體外分裂增殖能力強,可以在不同的誘導條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等,被認為是骨組織工程中重要的種子細胞。本實驗通過體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞,并利用間充質(zhì)干細胞成骨分化培養(yǎng)基使其向成骨細胞方向分化后進行成骨分化鑒定,為后續(xù)lncRNA表達譜芯片檢測實驗做準備。研究方法：1.將購買的原代hMSCs進行擴增培養(yǎng)至P2代,并將P2代hMSCs在間充質(zhì)干細胞成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7、14、21天后,對其細胞形態(tài)進行觀察。2.以hMSCs成骨誘導分化7天、14天、21天后的細胞作為實驗組(分別記為D7、D14和D21),以成骨誘導分化前的hMSCs作為對照組(記為DO)。通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素紅染色進行成骨分化的鑒定。3.對D0、D7、D14及D21組細胞樣本進行細胞總RNA提取,然后對樣本RNA進行質(zhì)量鑒定。4.利用實時熒光定量PCR (RT-PCR)檢測成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix、ALP、 OPN)表達情況來進行成骨分化的鑒定。研究結果：1.原代hMSCs傳代培養(yǎng)至P2代,細胞生長狀態(tài)良好,呈形態(tài)均一的長梭形。經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)后細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?隨著培養(yǎng)時間延長,細胞增殖加快,7天時可見細胞聚集成團,誘導14天及21天時可見到棕黑色的鈣結節(jié)。2.P2代hMSCs進行ALP染色及茜素紅染色,結果均為陰性。將成骨誘導7、14、21天后的細胞行ALP染色,胞質(zhì)中呈現(xiàn)紅色,提示ALP染色結果為陽性；行茜素紅染色,可見紅色的鈣鹽沉積,提示茜素紅染色結果為陽性。3.D0、D7、D14、D21樣本RNA的A260/A280值均為1.8-2.0,說明總RNA具有較高的純度；RNA完整性：經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測,RNA樣品電泳條帶清晰,28S：18S rRNA條帶亮度大于或接近2：1,質(zhì)量符合進一步RT-PCR實驗及后續(xù)表達譜芯片實驗要求。4.RT-PCR檢測hMSCs成骨誘導分化前后Osterix、ALP、OPN的表達變化,結果顯示與hMSCs成骨誘導分化前相比,成骨誘導分化后Osterix、ALP、OPN的表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第二章人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化前后差異表達lncRNA的篩選及驗證研究目的：本實驗通過lncRNA表達譜芯片檢測技術篩選出hMSCs成骨分化前后差異表達的lncRNA表達譜特征,初步探討了lncRNA在hMSCs成骨分化過程中的重要作用。但是基因芯片檢測存在一定的假陽性率,必須通過其他的方式加以驗證,因此我們從芯片檢測結果中隨機選取5個差異表達lncRNA(2個上調(diào)的lncRNA:ENST00000523786.1和ENST00000436715.1,3個下調(diào)的IncRNA: ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2)進行實時熒光定量PCR檢測,以進一步驗證芯片結果的準確性。研究方法：1.D0、D7、D14及D21組細胞樣本RNA質(zhì)檢合格后,進行體外擴增和熒光標記,將標記后的產(chǎn)物與Agilent公司人IncRNA V3.0芯片雜交過夜。使用Agilent芯片掃描儀對芯片進行掃描,得到雜交圖片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù)(包括IncRNA及mRNA數(shù)據(jù))。然后使用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析(設定差異基因篩選標準為Fold Change不低于2倍)。2.隨機選取5個差異表達IncRNA進行實時熒光定量PCR檢測,驗證芯片結果的準確性。研究結果：1.芯片檢測結果發(fā)現(xiàn)與成骨誘導分化前的hMSCs相比,成骨誘導分化7天、14天、21天后表達上調(diào)超過2倍的IncRNA分別有923條、1393條、1338條；下調(diào)超過2倍的IncRNA分別有993條、3843條、3688條；表達上調(diào)超過2倍的mRNA分別有1462條、4093條、3354條；下調(diào)超過2倍的mRNA分別有953條、2236條、1923條。與成骨誘導分化前的hMSCs相比,成骨誘導分化7、14、21天過程中持續(xù)表達上調(diào)超過2倍的IncRNA有433條,下調(diào)超過2倍的IncRNA有232條；持續(xù)表達上調(diào)超過2倍的mRNA有956條,下調(diào)超過2倍的mRNA有229條。2.RT-PCR驗證結果顯示與DO組相比,ENST00000523786.1和ENST00000436715.1在D7、D14、D21組中表達明顯上調(diào)(P0.05)；ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2在D7、D14、D21組中表達明顯下調(diào)(P0.05)。實時熒光定量PCR結果與芯片檢測結果一致。第三章人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化前后差異表達lncRNA和mRNA的生物信息學分析研究目的：初步探討hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達的mRNA可能與哪些基因功能和生物學通路的改變相關。并對芯片篩選結果中表達差異較大的lncRNA附近300 kb區(qū)域蛋白編碼基因進行分析,從而預測lncRNA作用的靶基因,這將有助于揭示一個新的受特定lncRNA分子調(diào)控的hMSCs成骨分化機制。研究方法：對hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達的mRNA進行基因本體論(Gene Ontology, GO)和KEGG生物學通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway analysis)。并選取芯片篩選結果中表達差異較大的lncRNA,根據(jù)其序列信息并結合芯片檢測結果中差異表達mRNA序列信息,對選取的lncRNA附近300 kb區(qū)域蛋白編碼基因進行分析。研究結果：1.GO分析結果顯示：在生物學進程(biological process, BP)方面,1MSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有680個基因富集于生物學進程,其中富集評分最高的是system development這一生物學進程,含有差異表達基因217個。在細胞組件(cellular component, CC)方面,hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有702個基因富集于細胞組件,其中富集評分最高的是extracellular matrix這一細胞組件,含有差異表達基因57個。在分子功能(molecular function, MF)方面,hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有631個基因富集于分子功能,其中富集評分最高的是carbohydrate derivative binding這一分子功能,含有差異表達基因28個。2.KEGG分析結果顯示：MSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有427個基因富集于生物學通路,并主要富集于31個生物學通路,其中富集評分最高的是Complement and coagulation cascades這一生物學通路,含有差異表達基因21個。3.我們從芯片篩選結果中選取hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)表達上調(diào)較大的lncRNA ENST00000585537.1及下調(diào)較大的lncRNA eHIT000015952,結合芯片篩選出的差異表達mRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)：lncRNA ENST00000585537.1位于第17號染色體,在其附近300kb區(qū)域內(nèi)存在3個蛋白編碼基因(MAP2K6、 TEKT1、ABCA5); lncRNA eHIT000015952位于第3號染色體,在其附近300kb區(qū)域內(nèi)存在7個蛋白編碼基因(如PAK2、MFI2、DLG1等)。全文結論：1.hMSCs在體外具有較強的成骨分化能力,在適當培養(yǎng)條件下可分化為成骨細胞。2.首次通過高通量lncRNA表達譜芯片檢測技術篩選出hMSCs成骨誘導分化前后差異表達lncRNA的表達譜特征,并利用實時熒光定量PCR對部分差異表達lncRNA予以驗證,證實了芯片結果的可靠性。3.GO分析：hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有680個基因富集于生物學進程,有702個基因富集于細胞組件,有631個基因富集于分子功能。KEGG分析：hMSCs成骨誘導分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有427個基因富集于生物學通路,并主要富集于31個生物學通路。4.對部分差異表達lncRNA近蛋白編碼基因進行生物信息學分析,提示差異表達的lncRNA在hMSCs成骨分化過程中可能作用的靶基因。5.為研究hMSCs成骨分化提供新的lncRNA靶點,從而為構建更理想的組織工程骨移植物提供新的理論基礎。
【關鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨分化 長鏈非編碼RNA 實時熒光定量PCR 生物信息學分析
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R782.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-23
• 第一章 人骨髓間充質(zhì)干細胞與成骨誘導分化細胞的培養(yǎng)及鑒定23-40
• 1 材料和方法23-32
• 2 統(tǒng)計方法32
• 3 結果32-38
• 4 討論38-39
• 5 小結39-40
• 第二章 人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化前后差異表達lncRNA的篩選及驗證40-69
• 1 材料和方法40-47
• 2 統(tǒng)計方法47
• 3 結果47-65
• 4 討論65-68
• 5 小結68-69
• 第三章 人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化前后差異表達lncRNA和mRNA的生物信息學分析69-84
• 1 材料和方法69-71
• 2 結果71-79
• 3 討論79-83
• 4 小結83-84
• 全文小結84-85
• 參考文獻85-91
• 成果91-92
• 致謝92-93

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張科強;劉一;王寶剛;羅揚;;體外沖擊波誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中c-fos、c-jun的表達[J];山東醫(yī)藥;2008年04期

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本文編號：1094375