本文關(guān)鍵詞：納米羥基磷灰石珊瑚骨塊對臨界慢性下頜骨缺損修復(fù)的影響

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【摘要】：研究背景臨床上,牙周病、腫瘤等常會造成較大范圍的頜骨缺損,此類缺損一般無法自行修復(fù),需要進行骨移植。自體骨移植是公認的骨缺損修復(fù)金標準,但由于來源有限,存在附加損傷、疼痛和感染機會等并發(fā)癥問題,臨床應(yīng)用常常受限。在眾多異體骨移植材料中,羥基磷灰石珊瑚人工骨(hydroxyapatite/coralline, HA/coral),又名珊瑚羥基磷灰石(coralline hydroxyapatite, CHA),是一種通過熱液置換的方法將碳酸鈣轉(zhuǎn)換成羥基磷灰石的可生物降解人工合成類支架材料,它不僅保留了天然珊瑚的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),還具有羥基磷灰石良好的生物相容性、機械強度、骨傳導(dǎo)性等等。有研究顯示：顆粒型CHA在牙周組織再生中能提高牙周韌帶細胞(periodontal ligament cell, PDLC)的附著；還有學(xué)者對其成骨機制和成骨效能進行研究,發(fā)現(xiàn)成骨細胞和膠原骨基質(zhì)沿顆粒間隙包繞成骨,成骨均一且成骨效能良好。目前,顆粒型CHA常常被應(yīng)用于牙周和種植外科的引導(dǎo)骨組織再生中。但是,對于較大范圍的頜骨缺損修復(fù)來說,顆粒型珊瑚羥基磷灰石容易受咀嚼等外力作用發(fā)生形變,形態(tài)和空間維持方面欠理想；相比之下,羥基磷灰石珊瑚骨塊易塑形,空間維持能力強,大小不受限,甚至可根據(jù)缺損形狀進行定制。盡管珊瑚羥基磷灰石骨塊可以克服顆粒型珊瑚羥基磷灰石的上述諸多不足,但至今仍未能在臨床上廣泛應(yīng)用,因為有研究發(fā)現(xiàn)：塊狀骨移植的成骨效果比顆粒狀的效果差。還有研究認為,大范圍骨缺損常伴隨受區(qū)血運欠佳,即便使用了理想的支架材料,也會由于骨塊中心部位營養(yǎng)和氧氣缺乏而影響血管和骨組織的新生,造成缺損中心和外周成骨不均,嚴重者甚至?xí)霈F(xiàn)壞死。因此,如何提高骨塊移植的血管新生是羥基磷灰石珊瑚骨塊是否能得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。眾所周知,骨組織缺損修復(fù)是一個涉及到血塊機化、成骨細胞和巨噬細胞向傷處遷移、增殖、分化以及血管和編織骨新生的一系列復(fù)雜過程。其中,血管生成是骨組織愈合早期的重要因素。因此,支架血管化被認為是缺損修復(fù)中骨移植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要手段。在組織工程中,支架血管化處理方法有很多,包括干細胞移植法、聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染細胞移植法和生長因子復(fù)合法等等。其中生長因子復(fù)合法是通過組織工程的方法將生長因子吸附于支架上,利用其緩釋載體作用進而實現(xiàn)支架的血管化。在諸多生長因子中,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的強效多功能細胞生長因子,不僅能在血管生成初期高度特異性的促進內(nèi)皮細胞有絲分裂,誘導(dǎo)細胞遷移、增殖,分化為血管內(nèi)皮細胞,控制細胞凋亡,改善新生血管的形成,同時還能上調(diào)骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)的表達,誘導(dǎo)成骨細胞遷移、增殖、分化,促進新骨生成。當(dāng)然,單純的VEGF極易在局部降解,很難在較長時間內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用,需要通過支架材料作為載體緩慢釋放。羥基磷灰石珊瑚骨塊中的羥基磷灰石具有非共價吸附血管內(nèi)皮生長因子的功能基團如：-OH,-NH2,-COOH-;同時,其開放連通的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)和理想的孔徑大小能增加支架的表面積,有利于生長因子的緩釋。因此,以珊瑚羥基磷灰石骨塊為支架材料,通過物理吸附的方法復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子。納米支架材料在骨組織工程中不斷受到關(guān)注,納米級的羥基磷灰石能模擬天然骨的結(jié)構(gòu)和組成,有助于人體細胞及生物大分子對其識別；能于機體內(nèi)與膠原蛋白末端的氨基鍵合,形成具有特定生物活性的化學(xué)鍵合界面,具備與骨鍵合的能力；能為成骨細胞的黏附、膠原和骨鹽的沉積提供了適合的微環(huán)境；同時,與微米級羥基磷灰石相比,納米級羥基磷灰石的表面積明顯增加,更有利于骨細胞在材料表面粘附、遷移和生物礦化；此外,納米級羥基磷灰石能夠促進鈣磷沉積和類骨質(zhì)的礦化。目前,國內(nèi)外關(guān)于納米羥基磷灰石珊瑚骨塊修復(fù)頜骨缺損的研究甚少,關(guān)于其支架復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子的研究尚無報道,納米羥基磷灰石珊瑚骨塊是否能在臨床上廣泛應(yīng)用于頜骨缺損修復(fù)仍需深入研究。本研究建立臨界慢性下頜骨缺損動物模型,旨在通過納米羥基磷灰石珊瑚骨塊移植的動物實驗探索其成骨機制和成骨效能；并將血管內(nèi)皮生長因子復(fù)合在納米羥基磷灰石珊瑚骨塊后移植于臨界慢性下頜骨缺損,觀察其血管和骨組織新生的改善情況,旨在提高骨塊移植的血運和成骨,為納米羥基磷灰石珊瑚骨塊在臨床上廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。目的1.研究納米羥基磷灰石珊瑚骨塊移植成骨機制和成骨效能。2.研究血管內(nèi)皮生長因子對納米羥基磷灰石珊瑚骨塊修復(fù)臨界慢性下頜骨缺損的促血管和骨組織新生作用。方法1.利用掃描電鏡檢測商業(yè)珊瑚骨塊、商業(yè)納米羥基磷灰石珊瑚骨塊、人類皮質(zhì)骨塊、人類松質(zhì)骨塊,研究其表面形貌、孔徑、微觀晶體形態(tài)和直徑；通過能譜分析檢測nHA/coral骨塊表面化學(xué)元素含量；采用X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)檢測和物相分析研究nHA/coral骨塊的表面晶相。2.室溫下在超凈工作臺上將rhVEGF165溶解在無菌PBS緩沖液中,配制成12ug/ml VEGF/PBS溶液。將16塊納米羥基磷灰石／珊瑚骨塊獨立擺放于無菌培養(yǎng)皿上,將0.25毫升rhVEGF165溶液注射于骨塊內(nèi)(3μg rhVEGF165/骨塊),非共價的物理吸附rhVEGF165;將另外16塊納米羥基磷灰石／珊瑚骨塊注射等量無菌PBS緩沖液。靜置半小時后低溫?zé)o菌下保存。3.復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子的納米羥基磷灰石／珊瑚骨塊修復(fù)臨界慢性下頜骨缺損的動物實驗(1)動物實驗分為VEGF/nHA/coral和nHA/coral兩組,VEGF/nHA/coral組為實驗組,nHA/coral組為對照組。每組設(shè)3周、8周兩個觀察時間點。每只動物隨機標號,并于每側(cè)下頜骨建立四個標準化臨界慢性骨缺損,采用半口對照設(shè)計,隨機將VEGF/nHA/coral骨塊植于一側(cè)缺損中,將nHA/coral骨塊植于另一側(cè)。(2)建立臨界慢性下頜骨缺損模型。手術(shù)分為兩個階段。首先全麻下采用分根法拔除雙側(cè)下頜第二,三,四前磨牙以及第一和第二磨牙(P2-M2),沿牙槽嵴頂縱向切開粘骨膜,翻瓣,0.9%無菌生理鹽水冷卻下于雙側(cè)下頜骨的頰側(cè)制出四個標準化箱型臨界骨缺損(n=8),大小6x9x12毫米3(頰舌向距離為6mm,牙合齦向距離9mm,近遠中向距離為12mm),缺損間隔4毫米；完整保留舌側(cè)骨板,粘骨膜瓣復(fù)位,絲線間斷縫合。然后,術(shù)后8周時,全麻下重新沿牙槽嵴頂縱向切開粘骨膜,翻瓣,對箱型慢性骨缺損進行重新塑形,按照半口對照設(shè)計,將16塊納米羥基磷灰石/珊瑚骨塊和16塊VEGF/納米羥基磷灰石/珊瑚骨塊組分別植入骨缺損內(nèi),制作減張切口,粘骨膜瓣復(fù)位,絲線間斷縫合。(3)3周、8周處死動物,對骨塊及相鄰骨組織進行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察和組織形態(tài)學(xué)測量分析。制作脫鈣切片,進行HE染色、Masson染色和vWF免疫組化染色,通過HE染色法觀察3、8周骨缺損修復(fù)中骨細胞、血管和骨基質(zhì)的生成情況,利用IPP軟件測量新生骨面積百分比,對照組和實驗組樣本量均為8個；通過Masson染色法觀察3、8周骨缺損修復(fù)中骨膠原基質(zhì)的分泌情況；利用vWF免疫組化染色法研究血管新生情況,通過IPP軟件檢測新生血管密度,對照組和實驗組樣本量均為8個。制作硬組織切片,采用雙熒光標記法通過共聚焦顯微鏡觀察不同熒光標記時間點的新骨生成情況以及骨塊降解情況,利用IPP軟件測量鈣化新生骨面積比,對照組和實驗組樣本量均為8個；通過甲苯胺藍染色法研究實驗組和對照組骨塊移植不同觀察時間點的新骨生成情況。4.采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件,對硬組織切片熒光標記的鈣化新生骨面積比、脫鈣切片HE染色的新生骨面積百分比、vWF免疫組化染色的新生血管密度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。上述測量結(jié)果均以平均值±標準差來表示,首先對組織形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗,若滿足正態(tài)分布和方差齊則以2×2析因設(shè)計的方差分析來檢測處理因素的主效應(yīng)和時間的交互作用。對于單獨處理效應(yīng)的分析,若滿足正態(tài)分布和方差齊則利用兩獨立樣本t檢驗進行整體均數(shù)的比較；若不滿足正態(tài)分布或方差不齊則采用兩獨立樣本t'檢驗比較整體均數(shù)。假設(shè)檢驗為雙側(cè)檢驗,檢驗水準P=0.05。當(dāng)P0.05時,差異被認為無統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)P0.05時,差異被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1. coral骨塊、nHA/coral骨塊、人類皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的微觀粗糙表面相類似,多孔結(jié)構(gòu)相互連通,其孔徑大小在62-164μm范圍內(nèi)；在nHA/coral骨塊表面均勻分布著指狀的直徑為71-99nm的羥基磷灰石晶體,與人類皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的納米級結(jié)構(gòu)非常類似。能譜分析結(jié)果顯示nHA/coral骨塊含有的化學(xué)元素主要為鈣、碳、氧、磷。XRD檢測結(jié)果證實nHA/coral骨塊的表面晶體成分為羥基磷灰石和碳酸鈣。2.納米羥基磷灰石/珊瑚骨塊具有良好的浸潤性,0.25毫升12ug/mlVEGF/PBS溶液恰好完全浸潤整個骨塊,單個nHA/coral骨塊內(nèi)含3μg rhVEGF165。3.復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子的納米羥基磷灰石/珊瑚骨塊修復(fù)臨界慢性下頜骨缺損的動物實驗(1)大體觀察結(jié)果顯示：術(shù)后4只比格犬均無死亡,飲食、活動正常,下頜骨移植術(shù)區(qū)無紅腫、化膿,無骨塊松動脫落等并發(fā)癥；3周、8周后,大體標本見植骨區(qū)愈合良好,骨生長良好,植骨區(qū)與宿主骨邊界較清晰。(2)脫鈣切片HE染色組織學(xué)觀察和組織形態(tài)學(xué)分析3周時nHA/coral組在骨缺損區(qū)近宿主骨-骨塊交界處可見有稀疏骨小梁和伴行的血管結(jié)構(gòu),并沿著支架向網(wǎng)孔內(nèi)部生長,骨塊內(nèi)部新骨和血管與界面處相比明顯較少,在支架中央幾乎無新生組織長入,少見炎癥細胞浸潤。在新生血管結(jié)構(gòu)中,大量的血管內(nèi)皮細胞環(huán)狀排列形成的新生血管和管內(nèi)的血細胞清晰可見；在新骨小梁結(jié)構(gòu)中還能見沿著脫鈣的支架網(wǎng)孔間隙有線形排列的成骨細胞呈多形性,增生活躍。而VEGF/nHA/coral組的新生骨組織結(jié)構(gòu)、分布與nHA/coral組相類似,數(shù)量相對較多。8周時隨著觀察時間的增長,兩組新骨和血管生成均明顯增多,不僅在骨塊的外周可見大量的新生組織,在支架內(nèi)部很容易發(fā)現(xiàn)新生骨組織和血管系統(tǒng),骨小梁明顯增寬,并在局部出現(xiàn)少量的板層骨結(jié)構(gòu)。VEGF/nHA/coral組的支架內(nèi)的新生組織情況與nHA/coral組相類似,數(shù)量相對略多。組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果顯示：nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組的新生骨面積百分比分別為21.7±4.6%和27.3±5.8%；nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組的新生骨面積百分比分別為32.6±7.2%和39.3±7.8%。析因設(shè)計方差分析提示分組與時間之間不存在交互作用(P=0.815),即nHA/coral組與VEGF/nHA/coral組的差異在3w和8w均一樣。3周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=2.103,P=0.0540.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。8周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=1.764,P=0.0990.05,無顯著性差異。在nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組內(nèi),8周新生骨面積比均顯著高于3周,其中nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=3.577,P=0.0030.01；VEGF/nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=3.453,P=0.0030.01。(3)脫鈣切片Masson染色組織學(xué)觀察3周時nHA/coral組,新生骨小梁結(jié)構(gòu)可見新生骨膠原纖維排列稍為紊亂,結(jié)構(gòu)尚未成熟,呈淺藍色；而VEGF/nHA/coral組新生骨膠原纖維相對成熟,排整齊；類骨質(zhì)包繞成骨細胞形成骨細胞,形成骨陷窩,有鈣鹽沉積的骨細胞及骨陷窩結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)藍染。8周時nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組均可見藍色的骨細胞和骨樣組織以及成熟的骨性膠原纖維排列整齊而致密,成熟的新生骨組織膠原分布均明顯增寬增多,有部分編織骨形成,紅藍相間。(4)脫鈣切片vWF免疫組化染色和測量vWF為血管壁上血管內(nèi)皮細胞的標記物,其陽性著色區(qū)域代表血管。在不同時間觀察點的各組可見新生血管的分布于新骨相似,均存在邊緣血管生成明顯,而中心部位相對較少的現(xiàn)象。3周時,nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組的vWF陽性表達區(qū)域均主要分布在骨塊-宿主骨交界處,呈現(xiàn)大小不一的橢圓形,棕褐色著色；而在骨塊內(nèi)部棕褐色陽性表達明顯減少,在中央部位幾乎未見vWF陽性表達。VEGF/nHA/coral組的陽性表達區(qū)域略多,nHA/coral組則相對較少。8周時,隨著骨愈合時間增加,兩組的新生血管數(shù)量均有顯著增加,不僅是在骨塊外周區(qū)域,而且在支架內(nèi)部也明顯發(fā)現(xiàn)陽性表達區(qū)域的增加。nHA/coral組則較少,而VEGF/nHA/coral組的陽性表達區(qū)域則相對較多。組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果顯示：VEGF/nHA/coral組的新生血管密度為146±32.6個/mm2,顯著高于nHA/coral組(105±31.4個/mm2)。nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組的新生血管密度分別增至269±66.6和341±70.8個/mm2。析因設(shè)計方差分析提示分組與時間之間不存在交互作用(P=0.419),即VEGF/nHA/coral組與nHA/coral組的差異在3w和8w均一樣。3周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=2.56,P=0.0230.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。8周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=2.098,P=0.0550.05,無顯著性差異。nHA/coral和VEGF/nHA/coral組內(nèi)8周新生血管密度均顯著高于3周,其中nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=6.303,P=0.0010.01；VEGF/nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=7.081,P=0.0010.01。(5)不脫鈣硬組織切片雙熒光組織學(xué)觀察和組織形態(tài)測量新生骨螯合熒光劑而顯示綠色(鈣黃綠素)和黃色(鹽酸四環(huán)素)。3周時nHA/coral組綠色鈣黃綠素?zé)晒饷黠@呈現(xiàn)網(wǎng)狀,主要分布在支架周邊尤其是近宿主骨-支架界面處,而在骨塊內(nèi)部也不均勻的分布有少量綠色熒光。在近宿主骨-支架界面處見少量黃色四環(huán)素?zé)晒獬蕳l帶狀；而VEGF/nHA/coral組綠色鈣黃綠素?zé)晒鈳鄬^多,骨塊內(nèi)部明顯可見分布不均的綠色熒光。綠色熒光帶不僅包繞于網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的材料表面,還有部分進入到網(wǎng)孔狀空間內(nèi)。兩組的支架形態(tài)均較規(guī)則,未見明顯吸收情況。8周時兩組黃色和綠色熒光標記的新骨在支架周邊和內(nèi)部均明顯增多,黃色四環(huán)素?zé)晒庠谥Ъ軆?nèi)不同部位均有顯現(xiàn)。相比之下VEGF/nHA/coral組的熒光帶明顯多于nHA/coral組。兩組的支架形態(tài)仍較規(guī)則,除了在支架的孔壁結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)氣泡狀的二級孔結(jié)構(gòu)改變之外,基本未發(fā)現(xiàn)明顯的支架形態(tài)改變。組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果顯示：nHA/coral組和VEGF/nHA/coral組的鈣化新生骨面積比分別為0.79±0.22%和1.08±0.29%；VEGF/nHA/coral組和nHA/coral組的鈣化新生骨面積比分別為4.25±1.14%和5.21±1.07%。析因設(shè)計方差分析提示分組與時間之間不存在交互作用(P=0.248),即nHA/coral組與VEGF/nHA/coral組的差異在3w和8w均一樣。3周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=2.199,P=0.0450.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。8周統(tǒng)計數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,Levene's test檢查方差齊性；獨立樣本t檢驗結(jié)果為：t=1.725,P=0.1070.05,無顯著性差異。nHA/coral和VEGF/nHA/coral組內(nèi)8周鈣化新生骨面積比顯著高于3周,nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t'檢驗結(jié)果為：t'=8.43,P=0.0010.01；VEGF/nHA/coral組內(nèi)獨立樣本t'檢驗結(jié)果為：t'=10.497,P=0.0010.01。(6)不脫鈣硬組織切片甲苯胺藍染色組織學(xué)觀察在3周、8周兩組支架形態(tài)規(guī)則,均未見明顯降解。3周時實驗組和對照組在與宿主骨相接處的支架外圍均成骨明顯,而支架中心部位染色區(qū)域較少。8周時兩組新骨生成均明顯增多,有其是支架內(nèi)部成骨明顯,但是仍存在邊緣和中心成骨不均勻的現(xiàn)象。結(jié)論1.納米羥基磷灰石珊瑚骨塊具有與天然骨組織相似的粗糙表面、化學(xué)成分、納米級微觀結(jié)構(gòu)；同時具有理想的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),是符合骨組織工程要求的理想支架材料。2.納米羥基磷灰石珊瑚骨塊在臨界慢性頜骨缺損修復(fù)中理想的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)可以使細胞能通過網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)進入支架內(nèi)部進而形成血管和骨組織新生,并表現(xiàn)出具有良好的生物相容性、生物降解性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性,具有較高的成骨效能。3.血管內(nèi)皮生長因子能在骨愈合早期提高納米羥基磷灰石珊瑚骨塊移植的血管新生,促進新骨鈣化,但不能在整個骨愈合過程中直接提高新骨生成比例。
【關(guān)鍵詞】：納米羥基磷灰石 珊瑚 骨移植 血管內(nèi)皮生長因子 組織工程 支架
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R782.4
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-35
• 第一章 納米羥基磷灰石珊瑚骨塊的理化性質(zhì)檢測35-47
• 1.1 材料與方法35-37
• 1.2 結(jié)果37-43
• 1.3 討論43-46
• 小結(jié)46-47
• 第二章 血管內(nèi)皮生長因子對納米羥基磷灰石珊瑚骨塊修復(fù)臨界慢性下頜骨缺損影響的動物實驗47-90
• 2.1 材料和方法48-67
• 2.2 結(jié)果67-79
• 2.3 討論79-89
• 小結(jié)89-90
• 參考文獻90-103
• 全文總結(jié)103-104
• 中英文對照縮略詞表104-105
• 成果105-106
• 致謝106-109
• 統(tǒng)計學(xué)證明109

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本文編號：1030187