本文關(guān)鍵詞：人牙齦成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程化血管的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第一部分人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究目的:體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)。探討人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)在體外分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的潛能。方法:1牙齦組織的獲取和分離正常人牙齦組織取自河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科,患者下頜阻生齒拔除術(shù)。牙齦組織手術(shù)切取后帶回實(shí)驗(yàn)室,在無菌條件下分離牙齦上皮及結(jié)締組織,留取牙齦結(jié)締組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。2人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)的培養(yǎng)培養(yǎng)液選用含15%胎牛血清的L-DMEM。牙齦結(jié)締組織剪成1 mm×1 mm的組織塊,進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%融合后,進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。3人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)的鑒定3.1流式細(xì)胞儀檢測人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs),選擇波形蛋白(vimentin)抗體和CD31抗體鑒定成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。3.2人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)的RT-PCR鑒定TRIzol法提取成纖維細(xì)胞的總RNA;以分光光度計(jì)測定細(xì)胞總RNA的純度及濃度;應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA;以適量反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模版,在TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,然后置于凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描,以GAPDH作為內(nèi)參照校正,用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。3.3人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)免疫細(xì)胞化學(xué)染色采用鼠抗人vimentin單克隆抗體、鼠抗人iii型膠原單克隆抗體,通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測vimentin蛋白和iii型膠原蛋白在人牙齦成纖維細(xì)胞中的表達(dá)與分布。3.4人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)免疫熒光染色采用兔抗人s-100a4抗體和鼠抗人肌動(dòng)蛋白α(α-sma)抗體,通過免疫熒光染色法檢測s-100a4蛋白和α-sma蛋白在人牙齦成纖維細(xì)胞hgfs中的表達(dá)與分布。4生長曲線的測定采用mtt法測定第1~6代人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)1~7天的od490nm處的吸光值。5內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)中的表達(dá)采用vimentin,血管生成素受體2(tie2)抗體和血管生長因子受體2(vegfr2)抗體,通過westernblot半定量vimentin蛋白,tie2蛋白和vegfr2蛋白在不同vegf165濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中的表達(dá)量。real-timepcr相對定量法檢測不同vegf165濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中vimentin基因,tie2基因,血管生成素2(ang2)基因的mrna相對表達(dá)量。6誘導(dǎo)過程中的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡觀察8ng/mlvegf165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)0,7,14,21,28,35,42和50天時(shí)的形態(tài)學(xué)變化。7誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的鑒定7.1免疫細(xì)胞化學(xué)染色8ng/mlvegf165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞35天后,采用鼠抗人cd34單克隆抗體、鼠抗人cd31單克隆抗體,通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測cd34蛋白和cd31蛋白在誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。7.2免疫熒光染色8ng/mlvegf165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞35天后,采用血管性假血友病因子(vwf)抗體和上皮鈣粘附分子(e-cadherin)抗體,通過免疫熒光染色檢測vwf蛋白和e-cadherin蛋白在誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。7.3rt-pcr鑒定誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞中tie2基因的mrna相對表達(dá)量。7.4經(jīng)8ng/mlvegf誘導(dǎo)35天后,通過透射電鏡觀察誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。8流式細(xì)胞儀測定誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率采用cd34抗體和cd31抗體,通過流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞中cd34和cd31的陽性表達(dá)率,以評估人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)的轉(zhuǎn)化率。9成管能力測試檢測誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能將誘導(dǎo)前后細(xì)胞接種于24孔板的matrigel基質(zhì)膠中,olympusix71倒置顯微鏡下觀察管狀排列結(jié)構(gòu)和完整度并計(jì)數(shù)管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量,對誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)的功能進(jìn)行評估。結(jié)果:1人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的基本生長情況細(xì)胞多數(shù)呈長梭形,細(xì)胞核較大,呈圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)以組織塊為中心向周圍輻射生長,傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)好,3~4天即可生長達(dá)90%~100%。2人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的鑒定結(jié)果2.1流式細(xì)胞儀檢測人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)表面抗原vimentin和cd31表達(dá)結(jié)果培養(yǎng)的成纖維樣細(xì)胞表面抗原vimentin表達(dá)陽性,陽性率為(97.13±0.62)%;而表面抗原cd31表達(dá)率僅為(8.64±1.55)%。兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。2.2細(xì)胞rt-pcr鑒定結(jié)果細(xì)胞rt-pcr結(jié)果顯示人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)特異性表達(dá)vimentin,s-100a4和α-sma。然而,tie2在細(xì)胞中不表達(dá)。2.3細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果鼠抗人vimentin單克隆抗體和鼠抗人iii型膠原單克隆抗體染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。2.4細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定結(jié)果兔抗人s-100a4多克隆抗體和鼠抗人α-sma單克隆抗體熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞分別呈綠色熒光和紅色熒光表達(dá)。3人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)生長曲線測定結(jié)果結(jié)果顯示第2代或第3代人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的對數(shù)生長期比其余代次細(xì)胞增殖水平顯著升高(p0.05),而第2代或第3代細(xì)胞的對數(shù)生長期細(xì)胞增殖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)中的表達(dá)westernblot結(jié)果顯示,8ng/mlvegf165誘導(dǎo)時(shí)tie2蛋白和vegfr2的相對表達(dá)量最高。real-timepcr結(jié)果顯示,經(jīng)8ng/mlvegf165誘導(dǎo)時(shí)tie2基因和ang2基因的mrna相對表達(dá)量達(dá)到最高。westernblot結(jié)果顯示,誘導(dǎo)周期達(dá)到35天時(shí)tie2蛋白和vegfr2蛋白的相對表達(dá)含量最高。real-timepcr結(jié)果顯示,誘導(dǎo)周期達(dá)到35天時(shí)tie2和ang2基因的mrna相對表達(dá)量最高。5vegf165對誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)經(jīng)8ng/mlvegf165誘導(dǎo)7~14天,大部分細(xì)胞仍然呈現(xiàn)叢狀或束狀排列;14~21天時(shí),細(xì)胞逐漸排列形成多邊形上皮細(xì)胞樣結(jié)構(gòu);21~28天時(shí),細(xì)胞逐漸出現(xiàn)融合成簇現(xiàn)象,逐漸形成鵝卵石樣或鋪路石樣的生長排列形式;28~35天時(shí),絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣的生長形式以及形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。6免疫細(xì)胞化學(xué)染色對誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定鼠抗人cd34單克隆抗體和鼠抗人cd31單克隆抗體染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。7rt-pcr鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞tie2基因的表達(dá)rt-pcr結(jié)果顯示,與對照組相比,tie2基因在誘導(dǎo)后細(xì)胞中顯著表達(dá)。8免疫熒光染色對誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定兔抗人vwf抗體和兔抗人e-cadherin抗體熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞分別呈紅色熒光表達(dá)。9誘導(dǎo)后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察透射電鏡觀察顯示,細(xì)胞表面呈現(xiàn)微絨毛結(jié)構(gòu),細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)溶酶體結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞特有的weibel-palad小體(w-p小體)。10流式細(xì)胞儀檢測分析人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)向血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)分化的轉(zhuǎn)分化率誘導(dǎo)后細(xì)胞組cd34和cd31細(xì)胞表型陽性率與對照組相比,差異有顯著性,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。11成管能力測試實(shí)驗(yàn)比較誘導(dǎo)前后細(xì)胞形成小管的能力誘導(dǎo)形成的細(xì)胞組在matrigel基質(zhì)膠中24小時(shí)呈現(xiàn)管狀樣結(jié)構(gòu),與對照組相比,誘導(dǎo)組成管數(shù)目顯著增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。第二部分人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞的研究目的:體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)并誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell,vsmc),證實(shí)人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)具有在體外分化為血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)的潛能。方法:1人牙齦組織的獲取,分離和細(xì)胞的培養(yǎng)同第一部分。2人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的鑒定2.1人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的rt-pcr鑒定同第一部分。2.2人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)免疫細(xì)胞化學(xué)染色同第一部分。2.3人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)免疫熒光染色同第一部分。3生長曲線的測定同第一部分。4平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在誘導(dǎo)分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)中的表達(dá)采用波形蛋白(vimentin),肌動(dòng)蛋白α(α-sma)和肌球蛋白(sm-mhc)抗體,通過westernblot半定量vimentin蛋白,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在不同pdgf-bb濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中的表達(dá)量。real-timepcr相對定量法檢測不同pdgf-bb濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中vimentin基因,α-sma基因,sm-mhc基因,calponin1(cnn1)基因和平滑肌22α(sm22α)基因的mrna相對表達(dá)量。5誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡觀察10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)0,7,14,21,28和35天時(shí)的形態(tài)學(xué)變化。6誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定6.110ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)28天后,采用兔抗人α-sma抗體和鼠抗人sm-mhc抗體,通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在誘導(dǎo)后血管平滑肌樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。6.2采用cnn1抗體和sm22α抗體,通過免疫熒光染色檢測cnn1蛋白和sm22α蛋白在誘導(dǎo)后血管平滑肌樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。6.3rt-pcr鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞中α-sma基因和sm-mhc基因的表達(dá)量。6.4經(jīng)10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)28天后,通過透射電鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的基本生長情況:結(jié)果同第一部分。2人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的鑒定2.1細(xì)胞rt-pcr的鑒定細(xì)胞特異性表達(dá)vimentin基因和s-100a4基因,弱表達(dá)α-sma基因,不表達(dá)sm-mhc基因。2.2細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定:結(jié)果同第一部分。2.3細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定:結(jié)果同第一部分。3人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)生長曲線的測定結(jié)果:結(jié)果同第一部分。4平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)中的表達(dá)westernblot結(jié)果顯示,誘導(dǎo)濃度達(dá)到10ng/mlpdgf-bb時(shí),α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相對表達(dá)量最大;誘導(dǎo)周期達(dá)到28天時(shí),α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相對表達(dá)含量最高。real-timepcr結(jié)果顯示,當(dāng)經(jīng)10ng/mlpdgf-bb誘導(dǎo)時(shí)α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因和sm22α基因的mrna相對表達(dá)量最高;誘導(dǎo)周期達(dá)到28天時(shí),α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因,sm22α基因的mrna相對表達(dá)量最高。5誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)經(jīng)10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)誘導(dǎo)0~7天,大部分細(xì)胞仍然呈現(xiàn)叢狀;7~21天時(shí),部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài),細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)一段時(shí)間的減少狀態(tài),但仍然為叢狀排列;21~28天時(shí),細(xì)胞伸出偽足并相互連接,在密集與稀疏處相互交錯(cuò)略呈“峰谷”狀,可與成纖維細(xì)胞相鑒別;28~35天,絕大多數(shù)細(xì)胞已呈典型的“峰谷”狀生長排列方式。6免疫細(xì)胞化學(xué)染色對誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后細(xì)胞兔抗人α-sma抗體呈強(qiáng)陽性反應(yīng),鼠抗人sm-mhc抗體呈陽性反應(yīng)。對照組α-sma仍呈陽性反應(yīng),sm-mhc單克隆抗體呈陰性反應(yīng)。7免疫熒光染色對誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后細(xì)胞sm22α抗體和cnn1抗體分別經(jīng)rhodamine和fitc熒光染色呈陽性反應(yīng),胞漿分別呈紅色熒光和綠色熒光表達(dá)。8細(xì)胞rt-pcr檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞α-sma和sm-mhc基因的表達(dá)誘導(dǎo)組α-sma基因mrna的相對含量明顯高于未誘導(dǎo)組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);誘導(dǎo)組sm-mhc基因mrna的相對含量明顯高于未誘導(dǎo)組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。9誘導(dǎo)后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果透射電鏡觀察可見胞漿中有少量高爾基復(fù)合體,線粒體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),大量粗細(xì)不一的肌絲樣結(jié)構(gòu)或肌絲束以及電子密度較高的密體樣結(jié)構(gòu)等。第三部分兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)聯(lián)合類人Ι型膠原合成支架材料的生物學(xué)特性及其細(xì)胞相容性的研究目的:應(yīng)用凍干技術(shù)將類人i型膠原蛋白(human-likecollageni,hlc-i)合成高分子材料與兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)(acellularvascularmatrix,acvm)支架材料復(fù)合,制備acvm-0.25%hlc-i血管支架材料,探討其生物學(xué)特性及與細(xì)胞的相容性。方法:1acvm基質(zhì)的制備稱量家兔體重,注射麻醉并結(jié)扎預(yù)取動(dòng)脈分支,迅速切取血管,浸入生理鹽水中,沖洗管腔后浸入含有1%苯扎溴銨的pbs復(fù)合液中60分鐘,沖洗后0.1%胰蛋白酶處理6小時(shí),沖洗后移入1%tritonx-100中72小時(shí),制備的acvm基質(zhì)浸入pbs中保存于4?c冰箱。2acvm基質(zhì)he染色,觀察脫細(xì)胞情況。3acvm基質(zhì)masson染色,觀察脫細(xì)胞情況及acvm基質(zhì)中的膠原成分。4acvm與hlc-i的復(fù)合丙烯酸預(yù)處理acvm基質(zhì),紫外燈輻射30分鐘,蒸餾水洗凈數(shù)次后放入真空干燥器中;預(yù)處理acvm浸入到碳化二亞胺水溶性中,4oc冰箱中1小時(shí);將不同濃度hlc-i(0.10mg/ml,0.25mg/ml,0.50mg/ml,0.75mg/ml,1.00mg/ml)復(fù)合于acvm基質(zhì)表面12小時(shí);清洗后acvm-hlc-i支架減壓干燥,4oc保存?zhèn)溆谩?人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)的培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定,實(shí)驗(yàn)方法同第一部分。6mtt法測定hlc-i與acvm的交聯(lián)的最佳濃度在不同濃度acvm-hlc-i支架上接種人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs),分別培養(yǎng)1,4,7天時(shí)測量各孔o(hù)d490nm的吸光值,以確定hlc-i與acvm基質(zhì)交聯(lián)的最佳濃度。7支架的吸水性測試實(shí)驗(yàn)分為兩組,acvm-0.25%hlc-i支架組和acvm支架組,室溫條件下,分別稱量兩組材料浸入pbs前后的重量,干燥狀態(tài)下重量標(biāo)記為w0,浸濕24小時(shí)后重量標(biāo)記為w1。支架材料的吸水量百分比計(jì)算公式:w1-w0/w0×100%。8支架的力學(xué)性能測定采用zwick/roellz020型萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)來檢測標(biāo)本的拉伸強(qiáng)度,斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率。實(shí)驗(yàn)分為未脫細(xì)胞的兔血管組,單純acvm支架組和acvm-0.25%hlc-i支架組進(jìn)行檢測,記錄應(yīng)力和應(yīng)變,繪制出應(yīng)力-應(yīng)變曲線。9支架的壓力爆破實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為未脫細(xì)胞的兔血管組,單純acvm支架組和acvm-0.25%hlc-i支架組。用注滿生理鹽水的壓力槍進(jìn)行壓力爆破實(shí)驗(yàn)。10掃描電鏡觀察支架表面結(jié)構(gòu)a組為未脫細(xì)胞的血管組織;b組為acvm支架;c組為acvm-0.25%hlc-i支架,分別觀察支架的側(cè)面和內(nèi)面。11cck-8試劑盒檢測acvm-0.25%hlc-i支架的體外細(xì)胞毒性待測樣品分為acvm-0.25%hlc-i支架組和單純acvm支架組,鋪于96孔板中,與100μl細(xì)胞懸液培養(yǎng)24,48和72小時(shí),用cck-8試劑盒進(jìn)行檢測,酶標(biāo)儀測定各組在450nm處的吸光度,通過計(jì)算細(xì)胞毒性活力(%),即相對生長率來評價(jià)支架的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果:1acvm基質(zhì)大體觀察結(jié)果acvm基質(zhì)呈乳白色,管腔塌陷,管壁變薄,彈性消失并可折疊。2he染色觀察acvm基質(zhì)脫細(xì)胞程度結(jié)果顯示,內(nèi)膜層呈現(xiàn)透明狀,無藍(lán)染細(xì)胞核及細(xì)胞碎片等殘留物,中膜層已經(jīng)無平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu),未見藍(lán)染細(xì)胞核及細(xì)胞碎片等物質(zhì),整個(gè)管壁變薄,纖維結(jié)構(gòu)稀疏。3masson染色觀察acvm基質(zhì)膠原成分及脫細(xì)胞程度結(jié)果顯示,acvm基質(zhì)中血管內(nèi)皮細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞和大部分肌纖維等成分脫落,大部分為染成綠色的膠原纖維和少量染成紅色的肌纖維,但纖維結(jié)構(gòu)稀疏。4人牙齦成纖維細(xì)胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)的培養(yǎng)、傳代及鑒定結(jié)果結(jié)果同第一部分。5mtt法測定hlc-i與acvm支架的最佳復(fù)合濃度細(xì)胞接種于不同濃度hlc-i復(fù)合的acvm支架后經(jīng)1,4和7天培養(yǎng)后,mtt實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,0.25%hlc-i復(fù)合于acvm支架上更有利于細(xì)胞的增殖,即為acvm-0.25%hlc-i支架。6acvm-0.25%hlc-i的吸水性測試結(jié)果結(jié)果顯示,acvm-0.25%hlc-i支架與acvm支架相比,吸水能力無差別,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。7acvm-0.25%hlc-i支架材料的生物力學(xué)測定結(jié)果acvm-0.25%hlc-i支架的應(yīng)力和應(yīng)變均大于acvm支架,而與未脫細(xì)胞兔血管無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。acvm-0.25%hlc-i支架的抗拉伸能力與未處理的天然兔血管更加接近,而acvm支架的抗拉伸能力最差。acvm-0.25%hlc-i支架的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率均與未處理的天然兔血管相近,而acvm支架斷裂強(qiáng)度與未處理的天然兔血管相比有所降低,其斷裂伸長率卻有所增加。8acvm-0.25%hlc-i支架材料的壓力爆破實(shí)驗(yàn)結(jié)果acvm-0.25%hlc-i支架的爆破壓力大于單純acvm基質(zhì)的爆破壓力(p0.05);而acvm-0.25%hlc-i支架與未經(jīng)脫細(xì)胞處理兔血管的爆破壓力無差別(p0.05)。9掃描電鏡觀察acvm-0.25%hlc-i支架表面結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)經(jīng)0.25%的hlc-i復(fù)合后,掃描電鏡可見acvm-0.25%hlc-i支架與acvm基質(zhì)相比,纖維更加致密,內(nèi)膜層,中膜層和外膜層分界不清,各層均未見細(xì)胞分布。10acvm-0.25%hlc-i支架的體外細(xì)胞毒性測試結(jié)果acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的相對生長率(rgr)在24,48和72小時(shí)時(shí)各時(shí)間點(diǎn)均在75%以上,acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的體外細(xì)胞毒性評估均合格。隨著時(shí)間的增加(24,48和72小時(shí)),細(xì)胞在兩種支架材料上的增殖情況為逐漸上升的趨勢。第四部分體外構(gòu)建組織工程化血管及裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化的研究目的:采用分層方式將人牙齦成纖維細(xì)胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)誘導(dǎo)分化形成的血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell,vsmc)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell,vec)種植于acvm-0.25%hlc-i支架上構(gòu)建初級組織工程化血管,再將初級組織工程化血管埋植于裸鼠皮下進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn),探討人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)聯(lián)合acvm-0.25%hlc-i支架構(gòu)建組織工程化血管的可行性及裸鼠體內(nèi)作用力對構(gòu)建的組織工程化血管的影響。方法:1acvm-0.25%hlc-i支架材料的制備與處理,實(shí)驗(yàn)方法同第三部分。2acvm-0.25%hlc-i支架材料的消毒處理3eduapollo488標(biāo)記誘導(dǎo)形成的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)及鑒定標(biāo)記率4eduapollo488標(biāo)記血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)并種植于acvm-0.25%hlc-i支架采用多次沉淀法將eduapollo488標(biāo)記的誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)(1×106/ml)種植于acvm-0.25%hlc-i支架上,連續(xù)培養(yǎng)7天。5dapi標(biāo)記誘導(dǎo)形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)及熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記率6凝膠法種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)將dapi標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)與matrigel基質(zhì)按照4:1的比例混合制備成vecs-matrigel凝膠,均勻涂抹于種植有vsmcs-acvm-0.25%hlc-i支架材料的表面,置于37?c,5%co2的培養(yǎng)箱內(nèi),12小時(shí)后加入含15%fbs的1640:l-dmem=1:1的培養(yǎng)液,連續(xù)培養(yǎng)3天。7種子細(xì)胞種植支架后he染色觀察8種子細(xì)胞種植支架后免疫組化染色兔抗人肌動(dòng)蛋白(α-sma)抗體或鼠抗人肌球蛋白(sm-mhc)抗體特異性標(biāo)記acvm-0.25%hlc-i支架上的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)。鼠抗人cd34抗體和鼠抗人cd31抗體特異性標(biāo)記acvm-0.25%hlc-i支架表面生長的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)。9種子細(xì)胞種植支架后免疫熒光染色9.1免疫熒光單標(biāo)鑒定calponin1(cnn1)蛋白和平滑肌22α(sm22α)蛋白特異性標(biāo)記acvm-0.25%hlc-i支架表面及內(nèi)部生長的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc),熒光二抗采用fitc;血管性假血友病因子(vwf)蛋白和上皮鈣粘附分子(e-cadherin)蛋白特異性標(biāo)記acvm-0.25%hlc-i支架表面生長的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec),熒光二抗采用rhodamine,激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。9.2免疫熒光雙標(biāo)鑒定一抗采用兔抗人sm22α抗體和鼠抗人vwf抗體或鼠抗人cnn1抗體和兔抗人e-cadherin抗體;一抗采用兔抗人α-sma抗體和鼠抗人cd34抗體或鼠抗人sm-mhc抗體和兔抗人cd31抗體;熒光二抗采用山羊抗鼠rhodamine和山羊抗兔fitc或山羊抗兔rodamine和山羊抗鼠fitc進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。同時(shí)標(biāo)記acvm-0.25%hlc-i支架上的兩種細(xì)胞。10掃描電鏡觀察11裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)將單純acvm-0.25%hlc-i支架組和構(gòu)建的血管組植入裸鼠皮下。分別于術(shù)后第3、6、9周再次麻醉動(dòng)物,取出植入皮下的組織進(jìn)行固定,行組織學(xué)觀察,熒光染色觀察和壓力承受實(shí)驗(yàn)測定。11.1組織學(xué)觀察11.2eduapollo488和dapi熒光染色示蹤細(xì)胞11.3壓力承受實(shí)驗(yàn)測定實(shí)驗(yàn)分為裸鼠體內(nèi)埋植的單純acvm-0.25%hlc-i支架組,構(gòu)建的血管組和正常血管組,用注滿生理鹽水的壓力槍進(jìn)行壓力爆破實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1細(xì)胞示蹤標(biāo)記率結(jié)果eduapollo488標(biāo)記的誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)在熒光顯微鏡下可見90%以上的細(xì)胞被標(biāo)記上;經(jīng)dapi標(biāo)記的誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)在熒光顯微鏡下可見90%以上的細(xì)胞被標(biāo)記上。2體外構(gòu)建組織工程化血管2.1he染色觀察單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架時(shí),可見細(xì)胞在支架材料內(nèi)部及表面均勻生長;單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架表面時(shí),細(xì)胞單層排列分布于支架表面;種植兩種細(xì)胞于acvm-0.25%hlc-i支架時(shí)可見內(nèi)層為誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)層,中間為matrigel-vsmcs層,最外層為纖維支架層。2.2免疫組化染色結(jié)果單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架時(shí),細(xì)胞呈α-sma和sm-mhc抗原陽性反應(yīng)。單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架時(shí),細(xì)胞呈cd34和cd31抗原陽性反應(yīng)。2.3免疫熒光染色結(jié)果2.3.1免疫熒光單標(biāo)結(jié)果單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架時(shí),cnn1和sm22α抗原陽性反應(yīng),支架內(nèi)部和表面的細(xì)胞被fitc染成綠色熒光,細(xì)胞核被dapi染成藍(lán)色。單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架時(shí),vwf和e-cadherin抗原陽性反應(yīng),支架表面的細(xì)胞被rhodamine染成紅色熒光,細(xì)胞核被dapi染成藍(lán)色。2.3.2免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果分層種植于acvm-0.25%hlc-i支架的種子細(xì)胞中,支架材料內(nèi)部的細(xì)胞sm22α,cnn1,α-sma或sm-mhc抗原陽性反應(yīng),胞漿fitc呈綠色熒光表達(dá),表面的部分細(xì)胞vwf,e-cadherin,cd34或cd31抗原陽性反應(yīng),胞漿rhodamine呈紅色熒光表達(dá),細(xì)胞核均被dapi染成藍(lán)色。2.4掃描電鏡觀察結(jié)果結(jié)果顯示,橫斷面尚可見雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu),內(nèi)表面可見誘導(dǎo)形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)均勻分布且與支架具有良好的生物相容性,細(xì)胞與細(xì)胞之間呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)。3裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1標(biāo)本大體觀察3周時(shí),單純支架組和細(xì)胞支架組均位于裸鼠的皮下,周圍有極薄的裸鼠組織包裹,管腔坍塌,管腔中間有少量裸鼠組織長入;6周時(shí),管型結(jié)構(gòu)完整,裸鼠組織長入,使得管壁相對增厚,管腔中間有裸鼠組織長入;9周時(shí),管型結(jié)構(gòu)仍然完整,周圍和中間的裸鼠組織包裹增厚更明顯。3.2組織學(xué)觀察he染色可見,3周時(shí),單純支架組管壁結(jié)構(gòu)清晰,周圍有少量纖維組織包繞和少量炎細(xì)胞浸潤;細(xì)胞支架組管壁中有大量種植細(xì)胞和少量裸鼠細(xì)胞長入,周圍有少量纖維組織包繞和大量炎細(xì)胞浸潤。6周時(shí),單純支架組有少量降解,管壁中有裸鼠細(xì)胞長入,周圍少量炎細(xì)胞浸潤;細(xì)胞支架組管壁中有大量細(xì)胞,結(jié)構(gòu)清晰,周圍有纖維組織包繞,炎細(xì)胞浸潤減少。9周時(shí),單純支架組逐漸降解,周圍有大量纖維結(jié)締組織包繞和少量炎細(xì)胞浸潤;細(xì)胞支架組管壁仍然十分清晰,管壁中有大量細(xì)胞,大部分來源于誘導(dǎo)形成的血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec),少數(shù)來源于裸鼠細(xì)胞的長入,周圍少量纖維組織包繞,炎細(xì)胞浸潤幾乎看不到。3.3eduapollo488和dapi熒光染色示蹤細(xì)胞結(jié)果實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下植入培養(yǎng)9周后,acvm-0.25%hlc-i支架上誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)被eduapollo488標(biāo)記呈綠色熒光,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)被eduapollo488標(biāo)記呈綠色熒光,同時(shí)被dapi標(biāo)記呈藍(lán)色熒光,證實(shí)這些細(xì)胞來源于之前種植于支架的種子細(xì)胞。3.4壓力承受實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果acvm-0.25%hlc-i支架組與組織工程化血管組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);組織工程化血管組與正常血管組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)結(jié)論:1人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)能在體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)。2人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)能在體外誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)。3類人i型膠原蛋白(hlc-i)與兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)(acvm)聯(lián)合制備的acvm-0.25%hlc-i支架材料具備充分的促進(jìn)細(xì)胞粘附,細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移能力以及良好的機(jī)械性和生物力學(xué)性能。4人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec),分層種植于acvm-0.25%hlc-i支架材料上,體外能夠成功構(gòu)建組織工程化血管組織。5裸鼠體內(nèi)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)證實(shí),由人牙齦成纖維細(xì)胞(hgfs)誘導(dǎo)分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)和血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)聯(lián)合acvm-0.25%hlc-i支架材料,在裸鼠體內(nèi)生長9周,構(gòu)建的組織工程化血管組織形態(tài)完好。
【關(guān)鍵詞】：人牙齦成纖維細(xì)胞 組織工程 血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管平滑肌細(xì)胞 脫細(xì)胞血管基質(zhì) 類人I型膠原蛋白
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781
【目錄】：

• 中文摘要5-20
• 英文摘要20-35
• 英文縮寫35-37
• 引言37-40
• 第一部分 人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究40-113
• 前言40-42
• 材料與方法42-63
• 結(jié)果63-69
• 附圖69-98
• 附表98-100
• 討論100-105
• 小結(jié)105-106
• 參考文獻(xiàn)106-113
• 第二部分 人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞的研究113-174
• 前言113-115
• 材料與方法115-128
• 結(jié)果128-133
• 附圖133-161
• 附表161-162
• 討論162-168
• 小結(jié)168-169
• 參考文獻(xiàn)169-174
• 第三部分 兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)聯(lián)合類人 Ι 型膠原合成支架材料的生物學(xué)特性及其細(xì)胞相容性的研究174-213
• 前言174-176
• 材料與方法176-185
• 結(jié)果185-189
• 附圖189-201
• 附表201-203
• 討論203-208
• 小結(jié)208-209
• 參考文獻(xiàn)209-213
• 第四部分 體外構(gòu)建組織工程化血管及裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化的研究213-262
• 前言213-215
• 材料與方法215-223
• 結(jié)果223-227
• 附圖227-251
• 附表251-252
• 討論252-257
• 小結(jié)257-258
• 參考文獻(xiàn)258-262
• 結(jié)論262-263
• 綜述一 組織工程化血管內(nèi)皮細(xì)胞種子細(xì)胞的研究進(jìn)展263-275
• 參考文獻(xiàn)270-275
• 綜述二 組織工程化血管支架材料的研究進(jìn)展275-287
• 參考文獻(xiàn)282-287
• 致謝287-288
• 個(gè)人簡歷288

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本文編號：1003122