本文關(guān)鍵詞：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對神經(jīng)元存活、軸突生長及Aβ代謝的影響

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)隱匿起病,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多個重要區(qū)域呈逐漸進(jìn)展的退行性改變,是癡呆的主要病因。以β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta,Aβ)為靶點(diǎn)的免疫治療臨床試驗(yàn)近期宣告失敗,AD治療前景的嚴(yán)峻性和緊迫性日益突出,學(xué)者的目光開始重新回到AD相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究,期望為AD的治療尋求突破。AD患者腦內(nèi)最具特點(diǎn)的組織學(xué)變化包含由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)、細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)Aβ異常聚集和大量沉淀形成的老年斑(senile plaque,SP)、皮層和海馬等重要腦區(qū)內(nèi)的大量神經(jīng)元退化丟失,除此之外,神經(jīng)突觸的功能障礙也是AD病理發(fā)生中一個重要因素。參與AD發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)程的因素較多,不可干預(yù)因素方面有老齡化等,其他方面有遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥等因素,而高血壓和糖尿病等也是影響AD進(jìn)程的重要因素。研究較多的神經(jīng)營養(yǎng)素——腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)具有非常重要的作用。我們認(rèn)為,BDNF在腦內(nèi)的酶解轉(zhuǎn)化異常和含量水平異�？赡芘cAD的發(fā)病和進(jìn)展有重要關(guān)系。已有研究發(fā)現(xiàn),AD病人往往伴隨腦內(nèi)外BDNF水平的改變,并有假設(shè)提出將BDNF作為預(yù)測AD的生物學(xué)標(biāo)記物,但這種假設(shè)有待于更多的研究來證實(shí)。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn),作為BDNF前體蛋白的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(brain-derived neurotrophic factor precursor,pro BDNF),其本身也具有生物活性,能夠影響神經(jīng)細(xì)胞的多項(xiàng)生物功能。離體和在體實(shí)驗(yàn)表明,pro BDNF具有與其裂解產(chǎn)物成熟體BDNF(mature BDNF,m BDNF)不同甚至相反的生物學(xué)作用,能夠通過p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)等機(jī)制介導(dǎo)對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,引發(fā)神經(jīng)突觸功能障礙,甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為,由前體蛋白的酶裂解轉(zhuǎn)化異常等原因?qū)е碌膒ro BDNF/m BDNF比例失衡可能突顯了pro BDNF的負(fù)性生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而引發(fā)pro BDNF的各種神經(jīng)毒性作用。因此,深入研究pro BDNF對神經(jīng)細(xì)胞存活及其軸突的影響具有重要意義。Aβ是構(gòu)成SP的主要成分,腦內(nèi)Aβ的代謝異常和異常沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制中的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為,大量Aβ異常沉積產(chǎn)生神經(jīng)毒性,還可促發(fā)神經(jīng)細(xì)胞反應(yīng)性產(chǎn)生Aβ,最終導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生與清除失衡,形成惡性循環(huán)。當(dāng)皮層和海馬等區(qū)域出現(xiàn)大量Aβ沉積及老年斑形成時,神經(jīng)元往往出現(xiàn)凋亡和丟失,進(jìn)而引發(fā)一系列高級認(rèn)知功能的損害,即AD常見的記憶力減退、精神行為功能異常等表現(xiàn)。因此,如何能夠在維持神經(jīng)細(xì)胞功能的同時終止或減緩Aβ的繼續(xù)沉積是防治AD進(jìn)展的一個重要環(huán)節(jié)。由于血腦屏障對多種藥物的屏蔽作用,關(guān)于AD相關(guān)神經(jīng)毒性的研究大多局限于離體條件下。采用腦內(nèi)或腦室內(nèi)立體定向注射技術(shù)能夠準(zhǔn)確將干預(yù)藥物遞送至腦內(nèi),有效觀察在體情況下腦內(nèi)的病理變化進(jìn)程。研究表明,腦內(nèi)或腦室內(nèi)給予重組病毒等基因載體能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá),或給予低免疫原性抗體等外源性物質(zhì)可被神經(jīng)細(xì)胞有效攝取和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。因此,我們在本研究中采用重組抗裂解的pro BDNF以及能夠表達(dá)此重組蛋白的腺相關(guān)病毒基因整合載體(adeno-associated virus-pro BDNF,AAV-pro BDNF),以及腦內(nèi)Aβ沉積增加并即將出現(xiàn)行為學(xué)改變的適齡轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠(AD鼠,雌性,5月齡,APPswe PS1d E9):1.觀察離體情況下pro BDNF對神經(jīng)元存活和突起生長的影響,探討p75NTR在其中可能的介導(dǎo)作用;2.建立側(cè)腦室立體定向注射方法,檢測AAV-pro BDNF注射后不同時期重組pro BDNF蛋白在AD鼠腦內(nèi)的表達(dá)情況;3.研究在體情況下pro BDNF對AD鼠學(xué)習(xí)記憶功能和腦內(nèi)Aβ代謝的影響,以及p75NTR在其中可能的介導(dǎo)作用。一、材料和方法1.對p75NTR轉(zhuǎn)基因小鼠(129sv背景)進(jìn)行基因型鑒定,通過同種基因型的小鼠交配獲得野生型(p75NTR+/+)或基因敲除型(p75NTR-/-)的純合子胎鼠,分別用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。①新生海馬神經(jīng)元存活實(shí)驗(yàn):采用18日齡的純合子胎鼠(p75NTR+/+型或p75NTR-/-型)進(jìn)行新生海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng),設(shè)定不同濃度(0,10,30,100ng/ml)的重組抗裂解pro BDNF進(jìn)行干預(yù),24h后MTT法測定特定波長下(570nm)光密度值(OD);其后觀察在一定濃度的pro BDNF(30ng/ml)下給予不同濃度(0,10,30,100μg/ml)的p75NTR胞外段與人Ig G Fc段融合蛋白(p75/Fc,p75NTR競爭性抑制劑)20h后MTT法測定570nm處OD值,從而了解神經(jīng)元凋亡情況。②神經(jīng)元軸突生長實(shí)驗(yàn):分別采用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)和原代培養(yǎng)的新生皮層神經(jīng)元(p75NTR+/+和p75NTR-/-),給予30ng/ml的pro BDNF干預(yù),72h后通過結(jié)晶紫染色或免疫熒光染色顯示并測算兩種神經(jīng)元軸突長度;同時觀察加用30μg/ml p75/Fc后各組神經(jīng)元軸突長度變化情況。2.采用轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠(AD鼠,APPswePS1d E9,雌性,5月齡)進(jìn)行立體定位下側(cè)腦室微量注射0.1%溴酚藍(lán)(4μl),24h后取腦鑒定腦室內(nèi)擴(kuò)散情況。隨后同樣方法注射AAV-pro BDNF(8×1010vg,4μl)或生理鹽水(4μl,對照),術(shù)后4周和8周分別采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)檢測鼠腦內(nèi)pro BDNF蛋白表達(dá)水平。3.采用AD鼠(APPswePS1d E9,雌性,5月齡),立體定位下側(cè)腦室內(nèi)注射生理鹽水(NS)、AAV-pro BDNF(8×1010vg)、AAV-pro BDNF和小鼠源性p75NTR單克隆抗體(AAV-pro BDNF 8×1010vg+Anti-p75Ab 0.6μg),術(shù)后8周采用Morris水迷宮方法檢測AD鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化。4.采用ELISA法檢測AD鼠腦內(nèi)Aβ40、Aβ42并計算Aβ總水平;應(yīng)用免疫組織化學(xué)(6E10)和剛果紅(Congo red)染色方法顯示腦內(nèi)Aβ沉積和老年斑形成情況,并統(tǒng)計老年斑數(shù)量。二、結(jié)果1.pro BDNF對新生神經(jīng)元的存活有抑制作用,且隨pro BDNF的濃度升高其抑制作用增強(qiáng),在30ng/ml時出現(xiàn)抑制效應(yīng)較為明顯(P㩳0.05);pro BDNF對新生神經(jīng)元存活的抑制作用隨p75/Fc濃度的升高而減弱。pro BDNF(30ng/ml)能夠抑制激活后的SH-SY5Y和新生海馬神經(jīng)元的軸突生長,而p75/Fc(100μg/ml)能夠中和這種抑制效應(yīng)。pro BDNF對p75NTR-/-型神經(jīng)元的存活和軸突生長未顯示出明顯影響(P㧐0.05)。2.在采用0.1%溴酚藍(lán)進(jìn)行AD鼠側(cè)腦室定向注射24h后,取腦證實(shí)溴酚藍(lán)在腦室系統(tǒng)內(nèi)廣泛擴(kuò)散。隨后進(jìn)行側(cè)腦室注射AAV-pro BDNF,ELISA檢測結(jié)果顯示,4周和8周鼠腦內(nèi)pro BDNF表達(dá)水平較注射前明顯增加(4周時達(dá)高峰),顯著高于同時期假手術(shù)對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),說明AAV-pro BDNF經(jīng)側(cè)腦室注射后在8周內(nèi)腦內(nèi)pro BDNF均有明顯表達(dá)。3.Morris水迷宮顯示,在定位巡航試驗(yàn)的獲得性訓(xùn)練中三組小鼠間的巡航速度無明顯差異(P㧐0.05);AAV-pro BDNF組AD鼠在訓(xùn)練后其逃避潛伏期未出現(xiàn)明顯下降,在訓(xùn)練末期明顯高于假手術(shù)對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05)。在空間探索試驗(yàn)中,AAV-pro BDNF組的AD鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的時間與假手術(shù)對照組相比明顯縮短,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05)。而AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab組AD鼠在逃避潛伏期及在目標(biāo)象限內(nèi)時間與假手術(shù)對照組比較無明顯差異(P㧐0.05)。4.AAV-pro BDNF組AD鼠腦內(nèi)Aβ水平高于對照組(P㩳0.05)。AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab組AD鼠腦內(nèi)Aβ水平高于對照組,但低于AAV-pro BDNF組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05)。同樣,AAV-pro BDNF組AD鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量相對于對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),而AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab組AD鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量介于上述兩組之間,具有均統(tǒng)計學(xué)差異(P㩳0.05)。三、結(jié)論1.pro BDNF對培養(yǎng)神經(jīng)元的存活和軸突生長有抑制作用,且這種作用可能是通過受體p75NTR介導(dǎo)產(chǎn)生。2.pro BDNF可能通過p75NTR的介導(dǎo)增加AD鼠腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和異常沉積,并因此加劇AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損害。
【關(guān)鍵詞】：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體 阿爾茨海默病 原代培養(yǎng) p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體 β-淀粉樣蛋白
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對神經(jīng)元存活和軸突生長的影響17-33
• 2.1 材料與方法17-25
• 2.2 結(jié)果25-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 基因重組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體在阿爾茨海默病鼠腦內(nèi)的表達(dá)33-40
• 3.1 材料與方法33-36
• 3.2 結(jié)果36-38
• 3.3 討論38-40
• 第四章 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對阿爾茨海默病鼠學(xué)習(xí)記憶功能和腦內(nèi)Aβ 代謝的影響40-56
• 4.1 材料與方法41-47
• 4.2 結(jié)果47-54
• 4.3 討論54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 文獻(xiàn)綜述 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體研究現(xiàn)狀63-71
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果71-72
• 致謝72

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本文編號：996681