本文關(guān)鍵詞：Meynert基底核中microRNA-132和Egr-1在阿爾茲海默病程中的變化特征

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【摘要】：目的：膽堿能Meynert基底核(Nucleus Basalis of Meynert, NBM)是腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的主要產(chǎn)生腦區(qū),與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。NBM在阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease, AD)中嚴重受損。以往的針對死亡后人腦樣本和在體的研究發(fā)現(xiàn),在AD進程的早期(神經(jīng)病理學(xué)診斷之Braak分期Ⅱ-Ⅲ期)NBM神經(jīng)元激活伴隨著代謝活性增強,但是,在AD晚期(例如Braak Ⅴ-Ⅵ期)NBM呈現(xiàn)退行性改變。研究者在AD患者的前額葉(prefrontal cortex, PFC)也發(fā)現(xiàn)存在著神經(jīng)元活性于AD早期激活而于AD晚期降低現(xiàn)象,表現(xiàn)為大量的與突觸活性和可塑性調(diào)節(jié)相關(guān)的基因在AD早期上調(diào)而于AD晚期下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示,這種腦區(qū)活性先升后降的變化類型可能是AD病程中腦活性變化的較為普遍的現(xiàn)象,雖然也有其他現(xiàn)象存在。由于AD早期的這種神經(jīng)元活性激活可能具有神經(jīng)元保護作用,使得該階段腦功能獲得代償而缺乏AD的臨床表現(xiàn),因此揭示這種AD腦區(qū)活性早期激活而晚期降低的調(diào)控因素與工作機理,尤其是早期維護腦活性的因素,將對于全面、深刻理解AD發(fā)病機制、尋找激活A(yù)D晚期腦功能的治療策略或藥物靶點具有重要科學(xué)意義。本研究以兩個具有促進突觸活性和突觸可塑性功能,在AD病程中于PFC中顯示先升后降的基因表達改變模式,并且與AD病理學(xué)標記及膽堿能活性密切相關(guān)的分子,即miRNA-132(miR-132)和早期生長因子1(Early growth response1, Egr-1)作為候選分子研究這種調(diào)節(jié)機制。我們于死亡后人腦研究樣本,包含AD發(fā)展的整個進程,也即從AD的神經(jīng)病理學(xué)分期Braak0到BraakⅥ期期間,研究在NBM內(nèi)miR-132和Egr-1的表達變化,以及其與經(jīng)典AD病理標記即過度磷酸化的tau與細胞內(nèi)外的p-淀粉樣蛋白(Amyloid beta, A(3),以及與膽堿合成酶,即膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetylcholinesterase, ChAT)的關(guān)聯(lián)。我們還研究了它們與載脂蛋白E (apolipoprotein E, APOE)ε4攜帶情況的關(guān)聯(lián),以及與神經(jīng)元退行性變的參數(shù)包括細胞萎縮、細胞密度降低等的關(guān)聯(lián)。旨在探究miR-132和/或Egr-1是否可能參與AD進程中的膽堿能NBM活性變化調(diào)節(jié)。 材料與方法：我們采用由荷蘭人腦庫(Netherlands Brain Bank, NBB)提供的包含NBM的福爾馬林固定、石蠟包埋的下丘腦樣本進行研究。這些樣本包括非癡呆癥的對照者(Braak分期=0)以及AD不同進程中的患者,即從Braak分期=Ⅰ到Braak分期=Ⅵ的患者,每期樣本量n=7,共49個樣本。7期樣本之間按照性別、年齡、死亡后廷擱時間(postmortem delay, PMD)、腦脊液(Cerebro-Spinal Fluid, CSF) pH值、APOE基因型、死亡時間、組織固定和貯存時間等進行完好匹配以消除研究的混淆因素。我們還根據(jù)以往研究按主要臨床類型將腦研究樣本分為三大組,即Braak0-Ⅱ,主要為無癥狀(no symptom, NS)對照組；Braak Ⅲ-Ⅳ,王要為MCI組；Braak stage Ⅴ-Ⅵ,主要為AD組。我們選取位于穹窿和/或前聯(lián)合位置的NBM的Ch4-am或Ch4-al區(qū)腦片進行連續(xù)切片,分別采用硫堇染色定位并研究神經(jīng)元數(shù)目和神經(jīng)元萎縮觀察；采用免疫細胞化學(xué)染色(immunocytochemistry, ICC)包括采用AT8抗體檢測過度磷酸化的tau、采用4G8抗體檢測細胞內(nèi)、細胞外的Ap、采用抗ChAT抗體檢測NBM中的膽堿能神經(jīng)元、采用Egr-1抗體檢測Egr-1的表達量。此外我們還采用Gallyas銀染檢測嗜銀的神經(jīng)元纖維樣纏繞(Neurofibrillary tangles, NFT),并采用原位雜交技術(shù)(in situ hybridization, ISH)檢測miR-132的表達量。采用圖像分析獲得的整合光密度值(integrated opticaldensity, IOD)定量ICC和ISH信號。 結(jié)果：NBM中miR-132和Egr-1表達直到MCI期仍保持相對穩(wěn)定,而于AD后期(Braak Ⅴ-Ⅵ期)呈現(xiàn)顯著下降趨勢或呈現(xiàn)顯著下降(S-N-K,P=0.055和P0.05)。NBM中miR-132(r=0.49, P0.001)和Egr-1(r=0.61, P0.001)的表達量與ChAT表達量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。NBM的神經(jīng)元密度在AD進程中保持相對穩(wěn)定(ANOVA, P=0.101),但是細胞大小在AD后期顯著下降(K-W,與NS組比,P=0.00001；與MCI組比,P=0.007)。ChAT在AD早期保持穩(wěn)定,在AD后期開始下降(S-N-K, P0.05)。NFT和Ap在Braak Ⅱ和Ⅲ期之間顯著升高,之后,NFT繼續(xù)升高而Aβ直至Braak Ⅵ期都保持相對穩(wěn)定(S-N-K, P0.05)。在AD早期(BraakⅡ-Ⅳ期)NBM中由抗AT8染色的過度磷酸化的tau占主導(dǎo),而銀染的NFT和神經(jīng)氈(Neuropil threads, NT)在AD進程的后期(Braak Ⅴ-Ⅵ期)更為明顯。ChAT的表達量與過度磷酸化的tau成顯著負相關(guān)(r=-0.33,P=0.021),而與Ap沒有相關(guān)性,提示tau的病理變化而不是Ap與NBM的神經(jīng)退行性改變關(guān)系更為密切。此外,我們發(fā)現(xiàn)在所有的Braak分期中NBM內(nèi)的Ap都位于細胞外。最后,在MCI組,APOEε4攜帶者的ChAT顯著低于非ApoEε4攜帶者(S-N-K, P0.05);在NS組,APOEε4攜帶者的NBM內(nèi)Aβ高于非ApoEε4攜帶者(S-N-K, P0.05). 結(jié)論：從microRNA和Egr-1在AD進程中的變化我們得出：1)這兩個分子可能在AD早期對保持NBM膽堿能功能穩(wěn)定起作用；2)可能導(dǎo)致NBM的晚期退行性變。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默癥 小RNA-132 早期生長反應(yīng)因子-1 Meynert基底核 過磷酸化tau蛋白 β-淀粉樣蛋白
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 致謝5-6
• 序言6-11
• 中文摘要11-14
• Abstract14-18
• 縮略詞表18-21
• 1 引言21-23
• 2 材料和方法23-43
• 3 結(jié)果43-55
• 4 討論55-59
• 5. 結(jié)論與展望59-65
• 參考文獻65-69
• 附錄69-72
• 綜述72-104
• 參考文獻89-104
• 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果104

【共引文獻】

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本文編號：994673